姜黃素對直腸癌CD133+腫瘤干細胞樣細胞群放療敏感性的影響

舒小鐳 何笑冬 李 倩 王 穎 李少林 (重慶醫科大學，重慶 4033)

姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用。美國VITY維他命雜志報道，姜黃素的主要藥理作用有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗動脈粥樣硬化、抗衰老消除自由基及抑制腫瘤生長等〔1，2〕。目前直腸癌手術前放療已經成為癌癥治療的重要組成部分，但是經過研究腫瘤細胞對放療敏感性不高。本文旨在研究姜黃素對直腸癌CD133+腫瘤干細胞樣細胞群放療敏感性的影響。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 直腸癌CD133腫瘤干細胞免疫磁珠分選器、陽性分離柱和CD133-PE熒光染色抗體均購自北京泰澤瑞達科技有限公司。二甲基亞砜(DMSO)購自上海強智生物科技有限公司、姜黃素購自上海瑞谷科技有限公司，熒光染料碘化丙啶(PI)購自北京華越洋生物科技有限公司。膜聯蛋白V-異硫氮基熒光素(AnnexinV-FITC)試劑盒購自廣東省瑞博生物有限公司、噻唑藍(MTT)試劑盒購自北京天恩澤生物科技有限公司。guava easyCyte 8HT個人型高性能流式細胞儀購自美國默克密理博公司。應用姜黃素溶解于DMSO中，配置成1 mmol/L溶液備用。

1.2 細胞系與實驗動物 人直腸癌細胞T84(取自72歲的男性結直腸癌患者的肺部轉移灶)購自上海信然實業有限公司

1.3 研究方法

1.3.1 分選CD133+腫瘤干細胞 挑選對數期生長較好的T84細胞，經過胰酶消化、離心(1000 r/min，10 min)，直接倒去或者吸出上清液，多元緩沖液交換劑(PBE)液混懸細胞，每108個細胞加入 270 μl PB、150 μl Fc 受體阻斷劑及80 μl CD133 抗體磁珠，于孵育箱中孵育30 min;接著3 ml PBE溶液洗細胞1次，再次離心，倒上清，加PBE 500 μl充分混懸細胞，可以輕輕搖晃。將CD133陽性分離柱放于磁場，將細胞懸液慢慢加入分選株，等待自然流盡，重復2次，之后1 ml PBE液到分選柱中，自然流盡，30 min內應用流式細胞儀驗證細胞純度。

1.3.2 細胞增殖檢測 將分選出的CD133+腫瘤干細胞調整細胞懸液濃度，每孔加入100 μl，鋪板使待測細胞調密度至1000～10000孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)，分為姜黃素組、姜黃素聯合放療組、放療組，姜黃素均為0.5 μmol/L，放療組加入等量的生理鹽水;5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，直到細胞貼壁，每孔100 μl，設5個復孔;5%CO2，37℃孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察;每孔加入 20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，培養4 h。若姜黃素與MTT能夠反應，離心后棄培養液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖2～3遍后，再加入含MTT的培養液;終止培養，吸去孔中培養液;每孔加入150 μl DMSO，低速手搖振蕩10 min，使結晶物質充分溶解。在酶標儀OD 490 nm處測量各孔的吸光度值;同時設置調零孔(培養基、MTT、DMSO)，還要設置相應對照孔(細胞、培養液、MTT、DMSO)。實驗重復3次，提高準確率。

1.3.3 AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測 將分選出的CD133+腫瘤干細胞，鋪于6孔板上，5×105個/孔，把細胞培養液吸出，PBS洗滌貼壁細胞1次，加入一定量的胰酶消化液(可含有EDTA)消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化，加入步驟2A中收集的培養液、混勻，轉移至離心管內，1000 r/min離心5 min，吸去上清液，收集細胞，PBS輕輕重懸細胞并且細胞計數。注意:加入2A中的細胞培養液其中血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶(消化并降解后續加入的Annexin V-FITC導致染色失敗);取5～10萬重懸細胞，1000 r/min 離心 5 min，棄去上清，加 195 μl Annexin VFITC結合液輕輕晃動;加入5 μl Annexin V-FITC，室溫(20℃ ～25℃)避光孵育10 min;1000 r/min離心5 min，棄上清，加入190 μl Annexin V-FITC 重懸細胞;加入 10 μl PI，混勻，避光放置，流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色光，PI為紅色光。用于熒光顯微鏡下檢測，1000 r/min離心5 min，收集細胞，用80 μl Annexin V-FITC重懸細胞，涂片觀察。

1.4 研究指標 MTT法測定三組生長抑制情況;Annexin VFITC/PI雙染色檢測細胞凋亡率;

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行分析，計量資料以±s表示，兩組之間比較采用t檢驗，對于符合條件的多個均值之間的比較應用方差分析，有意義的行兩兩比較，采用Tukey-HSD;計數資料用百分比表示，采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 三組腫瘤細胞抑制情況 姜黃素組隨著時間變化腫瘤細胞抑制率變化不大(P＞0.05);放療組和姜黃素聯合放療組24、48、72 h細胞生長抑制率逐漸升高(P＜0.05);同期三組細胞生長抑制率均有統計學意義(P＜0.05)，兩兩比較24 h細胞生長抑制率，姜黃素組與姜黃素聯合放療組和放療組之間有統計學意義(P＜0.05)，姜黃素聯合放療組與放療組之間差異差異無統計學意義(P＞0.05);48 h抑制率兩兩之間差異均有統計學意義(P＜0.05);72 h抑制率兩兩之間差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 MTT法測定三組抑制率比較(%，±s)

表1 MTT法測定三組抑制率比較(%，±s)

與姜黃素組比較:1)P＜0.05;與放療組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 復孔 24 h 48 h 72 h F值 P值53.6±1.25.4±1.55.5±1.46.5450.073姜黃素聯合放療組姜黃素組519.2±3.61)31.6±3.71)2)46.5±3.81)2)34.5660.000放療組 515.3±2.51)23.7±2.71)34.3±2.91)25.3210.000 F值 － 44.48166.68360.224 － －P值 －0.0000.0000.000 － －

2.2 Annexin V-FITC/PI雙染色檢測細胞凋亡率 姜黃素組48 h與72 h之間細胞凋亡率差異無統計學意義(P＞0.05)，姜黃素聯合放療組和放療組差異具有統計學意義(P＜0.05)。同期內不同組細胞凋亡率之間的差異具有統計學意義(P＜0.05)，兩兩比較細胞凋亡率之間差異具有統計學意義(P＜0.05)，Annexin V-FITC/PI雙染色檢測細胞凋亡率右上和右下計為凋亡率。見圖1，表2。

表2 Annexin V-FITC/PI雙染色檢測細胞凋亡率(%，±s)

表2 Annexin V-FITC/PI雙染色檢測細胞凋亡率(%，±s)

組別 復孔 48 h 72 h T值 P值55.4±0.45.6±0.50.6430.528姜黃素聯合放療組 521.3±1.71)2)29.4±1.81)2)7.6170.000放療組 512.5±1.31)18.3±1.41) 3.8650.012 F值 - 25.43332.234 - -P值姜黃素組- 0.0000.000 - -

圖1 Annexin V-FITC/PI雙染色檢測細胞凋亡率

3 討論

姜黃素是植物多酚，是姜發揮藥用最重要成分，近年的研究不僅證明姜黃傳統中醫作用，而且還發現一些新的藥理作用〔3〕，如抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗人類免疫缺陷病毒、保護肝臟和腎臟、抗纖維化以及防癌抗癌等作用，可能與機體某些通路蛋白激活有關，而且無明顯的毒副作用〔4〕，有研究姜黃素對肝癌細胞(QGY)細胞增殖和細胞周期的調控及細胞凋亡的影響，采用MTT法測定姜黃素在不同濃度、不同時間對QGY的抑制作用，流式分析細胞周期，透射鏡觀察細胞結構變化〔5〕。結果姜黃素對QGY細胞有一定抑制作用，抑瘤率與藥物呈現劑量反應關系，72 h的IC 50為49.50 μmol/L，流式細胞儀分析證實姜黃素能聚積細胞在S期，電鏡發現姜黃素可使細胞壞死〔6〕，誘導細胞凋亡證明姜黃素可干擾QGY細胞的周期分布，具有細胞毒作用、抗增殖、誘導細胞凋亡的作用〔7〕。眾多的研究暗示姜黃素可能對腫瘤細胞的生長具有一定抑制作用，也有研究發現姜黃素可以增加放療的敏感性〔8，9〕。本文說明姜黃素可能并不能單純的起作用，必須和別的措施或者藥物協同起作用。

綜上所述，姜黃素可以增加直腸癌CD133+腫瘤干細胞樣細胞群放療敏感性，抑制腫瘤細胞生長促進細胞凋亡，臨床上對于直腸癌治療時可以使用，但是也要注意姜黃素使用的適應證以及預防可能出現的不良反應。

1 張 鵬，陳方敏，石家齊，等.增韌基團一姜黃素酯協同二甲雙胍對前列腺癌PC-3細胞凋亡的影響〔J〕.中華實驗外科雜志，2013;30(6):1181-3.

2 陳方敏，任德帥，石家齊，等.增韌基因-姜黃素酯對前列腺癌細胞體外靶向影響〔J〕.中華實驗外科雜志，2012;29(3):1066-8.

3 Valent P，Bonnet D，DeMaria R，et al.Cancer stem cell definitions and terminology:the devil is in the details〔J〕.Nat Rev Cancer，2012;12(11):767-75.

4 何利兵，王險峰，王紅勝，等.姜黃素衍生物體外抑制結腸癌細胞增殖侵襲作用〔J〕.中國癌癥雜志，2013;23(1):17-25.

5 呂文平，李世擁，安 萍，等.CD/5-FC對人直腸癌細胞輻射增敏作用的研究〔J〕.中華普通外科雜志，2002;17(7):440-2.

6 Takebe N，Warren RQ，Ivy SP.Breast cancer growth and metastasis:interplay between Cancer stem cells，embryonic signaling pathways and epithelial-to-mesenchymal transition〔J〕.Breast Cancer Res，2011;13(3):211-20.

7 劉雙林，王志華，胡志全.姜黃素對雄激素非依賴性前列腺癌抑制效應及其機制〔J〕.中華實驗外科雜志，2010;27(11):1711-3.

8 Yang CW，Chang CL，Lee HC，et al.Curcumin induces the apoptosis of humanm monocytic leukemia THP-l cells via the activation of JNK/ERK pathways〔J〕.BMC Complement Chem Med，2012;12:22.

9 Shi HS，Gao X，Li D，et al.A systemic administration of liposomal eurcumin inhibits radiation pneumonitis and sensitizes lung carcinoma to radiation〔J〕.Int J Nanomedic，2012;7:2601-11.