針刺對腦出血大鼠血清TNF-a、IL-6含量的影響

陳秋欣,鄒偉,牛明明,劉鵬,姚冬,包宇,孫曉偉

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針刺對腦出血大鼠血清TNF-a、IL-6含量的影響

陳秋欣1,鄒偉2,牛明明1,劉鵬1,姚冬1,包宇1,孫曉偉2

(1.黑龍江中醫藥大學,哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,哈爾濱 150040)

目的 探討針刺對腦出血大鼠運動功能及血清TNF-a、IL-6表達的影響。方法 將72只Wistar雄性大鼠隨機分為假手術組、模型組、針刺組。采用腦內自體血注射法制作腦出血大鼠模型。模型成功后,采用百會透曲鬢針刺法干預,1 d、3 d、7 d 3個時間點采用酶聯免疫吸附法檢測大鼠血清TNF-a、IL-6含量的變化。結果 針刺百會透曲鬢穴可明顯提高大鼠腦出血后神經功能評分,減輕神經功能缺損癥狀。同一時間點,針刺組大鼠血清中TNF-a和IL-6含量與模型組比較明顯降低,其差異具有統計學意義(＜0.01)。結論 針刺百會透曲鬢穴能降低腦出血大鼠神經功能缺損情況,可能與針刺后血清中的TNF-a和IL-6含量降低有關。

針刺;腫瘤壞死因子;白介素-6;腦出血;大鼠

腦出血是起病較急、病情較重、死亡率高、致殘率高的腦血管疾病。如何積極有效地降低神經功能的損傷,降低出血后炎癥反應,修復損傷的神經元,成為急性腦出血治療的重要內容。腦出血后,血腫周圍組織如小膠質細胞等炎性細胞被激活,釋放腫瘤壞死因子(TNF-a)、白介素-6(IL-1)等炎性因子,誘發炎癥級聯反應,加重腦水腫及神經元死亡,最終導致腦損傷和神經功能缺損加劇。TNF-a是具有多效性的促炎性細胞因子,而IL-6是一種主要由活化的單核巨噬細胞及B、T淋巴細胞和成纖維細胞、內皮細胞等分泌的具有多種生物功能的炎癥細胞因子。本文擬觀察針刺百會穴透刺曲鬢穴對實驗性腦出血大鼠運動功能及血清中TNF-a及IL-6含量的影響,探討針刺是否能調控炎癥反應來降低腦出血神經功能損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性Wistar大鼠,體重(350±20)g,由哈爾濱獸醫研究所提供[證書編號SCXK(黑) 20100027],實驗動物飼養室溫度為(22±2)℃,濕度為(50±5)%,氨濃度應≤14 rag/m3,噪音＜60 dB。

1.2 實驗試劑

TNF-a、IL-6試劑盒,購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 腦出血模型建立

參照張國威等[1]和Rosenberg GA等[2]報道的方法制作腦出血大鼠模型。將大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉,俯臥位固定于立體定位儀上,取頭皮正中,備皮消毒,正中切口,骨膜剝離器剝離骨膜,取前囟點(Bregma)點右旁開3.5 mm,后0.2 mm定點,用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm的圓孔,深達硬腦膜表面,鼠尾乙醇消毒,距尾端3 cm處剪斷鼠尾,用微量注射器取血50mL,將其固定在立體定位儀上,沿鉆孔進針約6 mm,將未肝素化的血液50mL以20mL/min速度推進腦內,留針5 min,緩慢出針。留針期間乙醇棉球包扎鼠尾斷端傷口,術后局部噴灑慶大霉素,用牙科水泥封閉顱骨傷口,縫合頭皮,局部皮膚采用碘酚消毒,防止局部感染影響指標觀察。術后2 h,采用Berderson評分法評價大鼠的運行功能,1～3分者納入本實驗。

1.4 動物分組及干預方法

將72只大鼠隨機分為假手術組、模型組、針刺組,每組按1 d、3 d、7 d分為3個亞組,每組8只。

假手術組:動物接受類似處理組的各項手術操作,但不進行注血制作。

模型組:腦出血模型成功后,不進行任何干預。

針刺組:腦出血模型制備12 h后進行針刺干預。

1.5 針刺方法

參照華興邦等制定的《實驗動物穴位圖譜》,取患側百會穴、曲鬢穴,采取百會穴透曲鬢穴針刺法,用0.35 mm×25 mm毫針針刺,進針0.8寸,留針30 min,其間捻轉3次,每次5 min,以200轉/min速度捻針。

1.6 指標檢測方法

1.6.1 神經功能評分

采用Berderson評分法測定針刺前后各組大鼠神經功能缺損程度。輕抓尾巴,提高于桌面10 cm,正常大鼠前爪伸直。0分為無神經功能缺損;1分為腦部病變對側腕關節、肘關節屈曲,肩內收屈曲;2分為上述體征加上向麻痹側推阻力下降;3分為活動時向麻痹側打圈(呈追尾狀);4分為不能自發行走,意識喪失。

1.6.2 血清TNF-a、IL-6含量測定

針刺治療1 d、3 d、7 d時間點結束后,給予水合氯醛麻醉,將其固定在解剖板上,剪去心前區被毛,消毒后開胸經心臟取血置于離心管中,靜置2 h,5000轉/min離心10 min,分離血清,置﹣20℃冰箱中備檢。采用酶聯免疫吸附法(Elisa)進行TNF-a、IL-6測定,操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 統計學方法

所有數據均采用均數±標準差表示,全部數據采用SPSS18.0統計分析軟件進行數據處理,組間比較采用方差分析,多重比較用或者法,以＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較

各組均出現不同程度病灶對側的偏癱,爬行時向右側劃圈,病灶對側前肢屈曲回收于腹下,癱瘓的后肢向后外展。在1 d時各組大鼠神經功能缺損最為嚴重,大部分大鼠有追尾現象或表現病灶對側肢體不能站立,之后神經功能缺損程度逐漸減輕。與模型組比較,針刺組大鼠神經功能缺損征有明顯恢復,在1 d和3 d神經功能評分均有顯著差異(＜0.01),7 d有統計學意義(＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損體征評分比較 (±s,分)

表1 各組大鼠神經功能缺損體征評分比較 (±s,分)

組別n1 d3 d7 d 假手術組80.00±0.000.00±0.000.00±0.00 模型組83.08±0.231)2.58±0.151)2.33±0.191) 針刺組82.00±0.172)1.92±0.202)1.50±0.153)

注:與假手術組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01,3)＜0.05

2.2 各組大鼠血清中TNF-a含量比較

造模后,各時間點血清中TNF-a含量較假手術組明顯增高,其中模型組在1 d、3 d、7 d時間點與假手術組比較差異有統計學意義(＜0.01)。經過針刺治療后,同一時間點的針刺組大鼠血清中TNF-a含量明顯下降,針刺組與模型組相比較,1 d、3 d、7 d時間點差異顯著(＜0.01)。說明針刺可以降低腦出血大鼠血清的TNF-a含量。詳見表2。

表2 各組大鼠血清中TNF-a含量比較 (±s,ng/L)

表2 各組大鼠血清中TNF-a含量比較 (±s,ng/L)

組別n1 d3 d7 d 假手術組81.34±0.461.89±0.201.41±0.21 模型組83.13±0.401)3.56±0.701)3.21±0.311) 針刺組81.93±0.532)2.41±0.702)2.18±0.702)

注:與假手術組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.3 各組大鼠血清中IL-6含量比較

造模后,各組大鼠血清中IL-6含量明顯增高,模型組與假手術組在各時間點比較差異具有統計學意義(＜0.01)。針刺治療后,針刺組與模型組相比較,同一時間點的針刺組大鼠血清IL-6含量明顯下降,各時間點比較,差異有統計學意義(＜0.01)。說明針刺可以降低腦出血大鼠血清的IL-6含量。詳見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-6含量比較 (±s,pg/L)

表3 各組大鼠血清中IL-6含量比較 (±s,pg/L)

組別n1 d3 d7 d 假手術組821.56±0.6022.90±0.2321.61±0.59 模型組830.79±0.901)35.02±0.161)30.81±0.261) 針刺組822.59±0.552)25.67±0.602)23.76±0.242)

注:與假手術組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

4 討論

腦出血發病機制目前尚未明確,但與動脈粥樣硬化、炎癥反應、血脂代謝紊亂、凝血機制異常等因素有關。近年來,炎性反應在腦出血病理生理機制中起著重要作用。急性腦出血的病理損傷除局部血腫占位性效應及對周圍腦組織的直接破壞作用外,局部和全身炎癥反應是繼發性腦損傷的主要組成部分。

炎性因子與腦出血病情發展呈正相關[3],TNF-a和IL-6是兩個重要的炎性因子。IL-6可由單核巨噬細胞、T細胞、B細胞、內皮細胞、成纖維細胞等多種細胞產生并作用于多種細胞,有廣泛的生物學活性,因此參與多種疾病的病理過程,如心肌梗死、糖尿病等[4-5]。腦出血后血腫周圍腦組織中IL-6水平增加,提升炎癥反應加重,回歸分析表明血清中IL-6水平是早期腦出血臨床癥狀加重的獨立因素。Dziedzic T等[6]發現腦出血患者血清IL-6和C反應蛋白水平升高,血清IL-6水平越高,患者的預后越差。TNF-a是由單核巨噬細胞和內皮細胞產生的具有廣泛生物學功能的多肽類細胞因子,通過抑制纖溶反應及活性蛋白C的抗凝作用,刺激內皮細胞釋放白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1),通過與IL-1協同使內皮細胞表面呈促凝狀態,從而促進血栓形成,加重腦血管疾病風險[7]。國內外研究也表明,TNF-a的高表達是造成腦出血后血管源性水腫形成的重要原因之一[8-9]。急性腦出血后,血腫周圍組織及血清中TNF-a的表達都顯著增強,提示TNF-a在急性腦出血的炎癥反應和腦水腫發展中發揮重要作用[10-11]。

本實驗采用Berderson神經體征評分法測定大鼠神經功能缺損程度,結果顯示1 d時各組大鼠神經功能缺損最重,多數大鼠有追尾現象或表現為病灶對側肢體不能站立,之后神經功能缺損程度逐漸減輕。與模型組比較,針刺組大鼠神經功能缺損征有明顯改善,其各時間段的神經功能評分均具有統計學意義,說明針刺能顯著改善腦出血大鼠神經功能缺損評分結果,減輕神經功能缺損癥狀。造模成功后,模型組大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量在1 d后開始增加,說明大鼠腦出血后炎性反應的存在,并且模型組血清中TNF-a及IL-6的含量與假手術組比較明顯增高,亦說明腦出血后腦組織中炎癥反應增加。針刺治療后,針刺組大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量較模型組減低,1 d、3 d、7 d時間點差異具有統計學意義,說明針刺能夠有效下調腦出血大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量,由此,我們推斷針刺能夠減輕腦出血后血清中TNF-a及IL-6的含量,從而減輕腦出血后炎性反應所引起的不良后果,從而達到減輕腦損傷的作用。

綜上,針刺百會透曲鬢能夠有效降低神經功能評分,改善神經功能缺損的癥狀,可能與針刺后通過下調大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量,從而減輕腦出血后炎性反應有關。

[1] 張國威,鄒偉,劉芳,等.針刺對腦出血急性期大鼠腦損傷及腦水腫拮抗作用的機理研究[J].針灸臨床雜志,2010,26(5):46-50.

[2] Rosenberg GA, Mun-Bryce S, Wesley M,Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J]. Stroke, 1990,21(5):801-807.

[3] 張健,陳干濤.急性腦出血患者IL-6和 TNF-a水平與預后的關系[J].實用癌癥雜志,2012,27(6):652-657.

[4] Vakili H, Ghaderian SM, Akbarzadeh NR,. Genetic polymer- phism of interleukin-6 gene and susceptibility to acute myocardial infarction[J]. Coron Artery Dis, 2011,22(5):299-305.

[5] Koh SJ, Jang YS, Hyun YJ,. Interleukin-6 (IL-6) -572C/G promoter polymorphism is associated with type 2 diabetes risk in Koreans[J]. Clin Endocrinol (Oxf), 2009,70(2):238-244.

[6] Dziedzic T. Clinical significance of acute phase reaction in stroke patients[J]. Front Biosci, 2008,13:2922-2927.

[7] Veréb Z, Lumi X, Andjelic S,. Functional and molecular charac- terization of ex vivo cultured epiretinal membrane cells from human proliferative diabetic retinopathy[J]. Biomed Res Int, 2013,2013: 492376.

[8] 崔向寧,李玉波,李妍.活血、利水中藥對腦出血大鼠腦組織腫瘤壞死因子-a、核轉錄因子-kB及水通道蛋白-4表達的影響[J].中國中西醫結合雜志,2012,32(2):203-208.

[9] Musumeci M, Sotgiu S, Persichilli S,. Role of SH levels and markers of immune response in the stroke[J]. Dis Markers, 2013, 35(3):141-147.

[10] 王興池.急性腦出血患者血清ICAM-1和TNF-a水平測定及分析[J].山東醫藥,2011,51(51):66-67.

[11] 劉振華,張清華,趙佳麗,等.血腫穿刺清除術對大鼠腦出血灶周組織中IL-6、TNF-a表達的影響[J].山東醫藥,2012,52(34):30-31.

Effect of Acupuncture on Serum TNF-aand IL-6 Contents in Cerebral Hemorrhage Rats

CHEN Qiu-xin1, ZOU Wei2, NIU Ming-ming1, LIU Peng1, YAO Dong1, BAO Yu1, SUN Xiao-wei2.

1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China; 2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine First Hospital,Harbin 150040,China

Objective To investigate the effect of acupuncture on motor function and serum expressions of TNF-aand IL-6 contents in cerebral hemorrhage rats. Method Seventy-two male Wistar rats were randomized into sham operation, model and acupuncture groups. A rat model of cerebral hemorrhage was made by intracerebral injection of autoblood. Baihui-to-Qubin acupuncture was performed after successful model making. The TNF-aand IL-6 contents of rat serum were measured by enzyme linked immunosorbent assay at three time points: one, three and seven days. Result Baihui-to-Qubin acupuncture markedly increased the neurological function score and reduced neurologic deficits in cerebral hemorrhage rats. At the same time point, serum TNF-aand IL-6 contents were significantly lower in the acupuncture group of rats than in the model and acupuncture group; there were statistically significant differences (＜0.01). Conclusion Baihui-to-Qubin acupuncture can reduce neurologic deficits in cerebral hemorrhage rats. It may be related to decreases in serum TNF-aand IL-6 contents after acupuncture.

Acupuncture; Tumor necrosis factor; Interleukin-6; Cerebral hemorrhage; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.10.1006

1005-0957(2015)10-1006-03

國家自然科學基金項目(81273824)

陳秋欣(1985 - ),女,2012級博士生,Email:chenqiuxin0451 @163.com

鄒偉(1965 - ),男,教授,Email:kuangzou2013@sina.com

2015-02-20