JNK信號轉導通路在黃芩苷誘導肝癌細胞凋亡中的作用

周 曙，蔡 濤，覃興貴，趙蕾蕾，薛 李

原發性肝癌位于全球癌癥致死的第4位，中國惡性腫瘤致死的第3位［1］。除手術根治性切除外，常規的治療即為術前或術后的輔助放化療。由于本病早期無明顯癥狀，故而診斷困難，導致病情延誤，過半患者在確診時已經喪失了手術根治的可能性。而化療藥普遍存在著毒性反應大和耐藥性等問題，并不能很好改善患者的生存時間和生存質量［2］。與常規化療藥相比，傳統醫藥以其獨特的藥理成分在抗癌、防癌的治療過程中占據優勢［3］。黃芩苷作為傳統中藥黃芩的提取物，是一種黃酮類化合物，具有抗炎、解熱、保肝的作用［4］。研究發現黃芩苷能夠抑制多種腫瘤細胞的凋亡，但是其具體機制尚未明確［5］。細胞內最常見的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路能夠控制細胞的增殖、分化和凋亡。而c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-teminal Kinase，JNK)作為MAPK家族中的一員，被認為在細胞凋亡中起到重要作用［6］。不僅如此，研究發現多種藥物通過調控JNK信號通路來誘導腫瘤細胞凋亡，對于黃芩苷是否能夠通過JNK信號通路抑制肝癌細胞尚不明確。因此，本研究旨在初步探討黃芩苷抑制肝癌細胞凋亡的作用機制，通過體外實驗研究黃芩苷是否通過激活JNK信號通路誘導肝癌細胞的凋亡，從而達到其抗腫瘤的功效，進而明確黃芩苷在肝癌治療中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 細胞:人肝癌HepG2細胞系(中國典型培養物保藏中心);試劑:黃芩苷(南京青澤醫藥有限公司)、SP600125(美國Sigma公司)、小牛血清(鄭州益康生物公司)、DMEM培養基(美國Hyclone公司)、二甲基亞砜(DMSO，美國 Sigma公司)、MTT細胞增殖與細胞毒檢測試劑盒(北京賽馳生物公司)、BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)、兔抗 JNK及 p-JNK一抗(美國 Cell signal公司)、山羊抗兔二抗(美國Santa Cruz公司)。儀器:倒置顯微鏡(日本 Olympus公司)、酶標儀(美國BIO-Rad公司)、細胞培養箱(美國Thermo公司)、凝膠圖像分析系統(上海天能公司)。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細胞培養:細胞從液氮復蘇后置于含10%小牛血清的DMEM培養基，5%CO2、37℃培養箱培養，每2～3 d取對數生長期細胞傳代1次。

1.2.2 MTT細胞增殖和細胞毒性實驗:將處于生長對數期的HepG2細胞用0.25%胰蛋白酶消化，輕柔吹打使細胞懸浮，離心后用DMEM培養基制備成濃度為1×104個/ml的細胞懸液。在96孔板每孔接種100 μl，培養24 h至細胞貼壁。用移液器吸去上清，加入150 μl含不同濃度黃芩苷的培養液(黃芩苷的終濃度分別為:50、100和150 μg/ml)，每個藥物濃度設3個復孔，同時設不加細胞只加培養液的空白對照孔，繼續培養24、48和72 h。吸去培養液每孔加入20 μl MTT，培養4 h后棄上清，每孔加入150 μl DMSO振蕩器低速振蕩10 min使結晶充分溶解，用酶標儀在450 nm波長下空白孔調零，檢測每孔的吸光(A)值，并重復以上實驗3次。黃芩苷對細胞的抑制率(inhibition rate，IR)計算公式如下:IR(%)=(A陰性孔－A實驗孔)/(A陰性孔－A空白孔)×100%。

1.2.3 Western blotting方法檢測JNK蛋白磷酸化:取對數生長期細胞1×104個/ml，接種于細胞培養瓶中，設置 4組細胞，A組加入不含黃芩苷或SP600125的細胞培養液，B組加入 10 μmol/L SP600125，C 組加入 100 μg/ml黃芩苷，D 組用10 μmol/L SP600125 預處理后加入 100 μg/ml黃芩苷。細胞繼續培養48 h后去上清，用預冷PBS清洗細胞3次，收集細胞至離心管，加200 μl細胞裂解液充分混勻，冰上放置10 min，4℃、12000 rpm離心5 min，上清轉移至干凈EP管。通過BCA法測蛋白濃度并用細胞裂解液將各樣品蛋白濃度調齊。配制5%的濃縮膠及12%的分離膠進行十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，冰上200 mA恒流轉移蛋白至PVDF膜，10%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加用10%脫脂奶粉稀釋(1:1000)的一抗4℃過夜。用TBST緩沖液充分振搖洗膜5次，加辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育2 h，TBST緩沖液洗膜5次，每次10 min。加顯色液，凝膠圖像分析系統拍照，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.4 SP600125阻斷劑對黃芩苷抑制細胞增殖的影響:在96孔板上接種100 μl處于對數生長期的細胞，加入SP600125(終濃度為10 μmol/L)預處理1 h，吸去 SP600125 后，加入 100 μg/ml黃芩苷培養液，繼續培養24、48、72 h，通過 MTT法檢測細胞毒性(操作同 1.2.2)。

1.3 統計學分析 所有資料均采用SPSS 18.0軟件進行統計學處理，計量資料用均數±標準差(±s)表示，兩均數比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 黃芩苷對HepG2細胞增殖的抑制作用 MTT細胞毒性實驗顯示黃芩苷對HepG2細胞的增殖具有抑制作用，其抑制強度隨藥物作用時間的延長而增加，結果見表1和圖1。經同一濃度黃芩苷處理的細胞在培養24、48和72 h 3個時間點IR均具有統計學差異(P＜0.01)，黃芩苷對人肝癌HepG2細胞增殖抑制作用呈時間依賴性。50 μg/ml與100 μg/ml黃芩苷處理的細胞在同一培養時間條件下IR均具有統計學差異(24 h:t=－4.15，P=0.014;48 h:t= －4.28，P=0.013;72 h:t= －4.11，P=0.015)，而 100 μg/ml與 150 μg/ml黃芩苷處理的細胞在同一培養時間條件下IR均不具有統計學差異(24 h:t= －0.36，P ＞0.05;48 h:t=-1.83，P ＞0.05;72 h:t= －0.31，P ＞0.05)。黃芩苷濃度低于100 μg/ml其對細胞的抑制作用隨濃度升高而增強;當黃芩苷濃度超過100 μg/ml時，其抑制作用不再隨濃度升高而增強。

2.2 HepG2細胞中JNK蛋白磷酸化程度比較 黃芩苷刺激后JNK總蛋白表達未見明顯變化，但JNK蛋白磷酸化程度升高，加入JNK信號通路特異性抑制劑SP600125后可阻斷JNK的磷酸化。見圖2。

2.3 SP600125阻斷劑處理后黃芩苷對HepG2細胞增殖的影響 細胞在加入黃芩苷前經SP600125預處理后，在3個不同時間點細胞抑制率均低于不經SP600125預處理細胞組(P＜0.01)，結果見表2。

表1 不同濃度的黃芩苷對HepG2細胞增殖的抑制率(±s，%)

表1 不同濃度的黃芩苷對HepG2細胞增殖的抑制率(±s，%)

注:與100 μg/ml比較，aP ＜0.05

黃芩苷濃度(μg/ml) 24 h 48 h 72 h F P 0.01 58.33 ±5.60 40.12 ＜0.01 100 38.01 ±4.72 64.74 ±6.83 81.36 ±7.91 32.75 ＜0.01 150 39.15 ±2.95 73.47 ±4.62 83.61 ±9.51 40.49 ＜50 25.69 ±2.03a 43.92 ±4.95a

圖1 不同濃度的黃芩苷對HepG2細胞增殖的抑制作用

圖2 4組HepG2細胞JNK磷酸化的變化

表2 HepG2細胞增殖抑制率的比較(±s)

表2 HepG2細胞增殖抑制率的比較(±s)

組別24 h 48 h 72 h黃芩苷38.01 ±4.72 64.74 ±6.83 81.36 ±7.91 SP600125+黃芩苷 8.78 ±2.75 16.31 ±4.10 25.38 ±6.72 t －9.3 -10.5 －9.2 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

常規放化療和傳統中醫藥主要通過誘導細胞凋亡發揮其抗癌的作用，而放化療在抑制腫瘤的同時也殺傷人體正常細胞，尤其是免疫細胞。目前，Brnjic［7］和 Bermudez［8］等發現 JNK 信號通路在放化療誘導細胞凋亡中起重要作用，是抑制腫瘤細胞凋亡必需的信號分子，并且必須持續激活才能達到其誘導細胞凋亡的作用。細胞凋亡為細胞的程序性死亡，凋亡過程受細胞內一系列分子的調控［9-10］。MAPK為一類絲蛋白/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內外信號傳導的主要傳導分子之一，在多種腫瘤發生發展中起到重要作用［11-12］。刺激信號通過激活MAPK激酶、MAPK激酶和MAPK形成磷酸化的三級級聯反應，激活下游控制細胞增殖或凋亡的信號分子。真核細胞中已經確認的MAPK信號分子包括ERK、p38MAPK、ERK5 和 JNK［13］。其中，JNK 由 JNK 激酶1、2(MKK4、MKK7)磷酸化后激活，激活后移動至細胞核，與轉錄因子ATF2結合，促進基因的轉錄和蛋白的合成［14］。研究發現JNK對細胞具有雙向調控機制，不同的細胞類型和不同的刺激方式下，JNK一方面誘導細胞凋亡，一方面促進細胞增殖［15］，其具體機制并不明確，個別研究認為似乎與JNK保持活化的時間長短相關［16］。研究同樣發現JNK在腫瘤中的作用復雜而多樣，一方面，不少研究發現腫瘤組織中JNK的活性增高，Yeh等［17］發現抑制JNK的表達可以降低乳腺癌MCF-7細胞的生長速率，并且促進乳腺癌MCF-7細胞的凋亡。相反的是，Brosseau等［18］通過 1，25 二羥維生素 D3 激活MCF-7細胞中的JNK信號通路后，發現細胞的凋亡率明顯增加。可見，腫瘤細胞內JNK信號通路在不同的誘導劑的作用下可能發揮不同的生物學效應。

傳統中醫藥認為黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、安胎的功效，以根入藥，《醫學衷中參西錄》中云“黃芩善入肝膽清熱”，可見黃芩同時也是治療肝臟疾病中一味常用的中藥［19］。研究發現黃芩在抗腫瘤的治療中同樣具有顯著效果，其有效提取物黃芩苷能夠誘導腫瘤細胞的凋亡，且不損傷人體正常細胞［20］。梁慧敏等［21］發現黃芩苷可以誘導人肝癌HepG2細胞的凋亡，細胞凋亡相關蛋白Caspase-9和Caspase-3的表達量均明顯增高，其機制尚不清楚。

本研究觀察了黃芩苷對人肝癌HepG2細胞毒性作用，并發現黃芩苷確實對HepG2細胞生長有抑制作用，其抑制作用隨藥物濃度和作用時間的增加而增加，具有量－效、時－效關系，但當黃芩苷濃度超過100 μg/ml時，其抑制作用不再隨濃度升高而變化，這可能是在該劑量黃芩苷的刺激下，細胞內的JNK信號通路的激活達到上限。通過Western blotting檢測黃芩苷處理后HepG2細胞JNK磷酸化的情況，結果顯示黃芩苷處理細胞后，JNK總蛋白表達未見明顯變化，而p-JNK蛋白明顯上調。該結果表明，黃芩苷確實激活了細胞內JNK信號通路，而且很有可能是通過激活JNK信號通路來誘導HepG2細胞的凋亡。為進一步驗證JNK信號通路在細胞凋亡中的作用，通過JNK抑制劑SP600125預處理HepG2細胞后發現SP600125能選擇性、可逆性地抑制JNK蛋白活性，阻止JNK的磷酸化以及磷酸化JNK在細胞內的積聚，由此阻斷JNK依賴的基因轉錄及細胞凋亡［22］。通過觀察SP600125阻斷劑處理后黃芩苷對HepG2細胞增殖的影響發現，HepG2細胞經SP600125預處理后細胞增殖的抑制率明顯低于未接受SP600125預處理的細胞。結果表明黃芩苷可通過激活JNK信號通路來誘導HepG2細胞的凋亡，阻斷JNK信號通路可降低黃芩苷對HepG2細胞的抑制作用。

以上研究結果顯示，用黃芩苷刺激肝癌HepG2細胞確實可以引起細胞凋亡增加，而且黃芩苷通過激活肝癌細胞內JNK信號通路來誘導細胞凋亡，為逐步開發黃芩苷的藥理作用奠定基礎，但是由于體外實驗的局限性，未來仍需要體內實驗進一步驗證黃芩苷對細胞內JNK信號通路的影響。

［1］張思維，鄭榮壽，李霓，等.中國肝癌發病的趨勢分析和預測［J］.中華預防醫學雜志，2012，46(7):587-592.

［2］趙偉，李昭宇.原發性肝癌的治療現狀［J］.寧夏醫科大學學報，2012，34(2):195-199.

［3］胡凱文.傳統中藥與腫瘤的對抗［J］.首都醫藥，2003，10(1):42-43.

［4］Bartlett G，Stewart J D，Tamblyn R，et al.Normal distributions of thermal and vibration sensory thresholds［J］.Muscle Nerve，1998，21(3):367-374.

［5］洪怡，何偉，李丹，等.黃芩苷脂質體的制備及體外抗腫瘤作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18(3):29-31.

［6］梁先敏，楊克敵.Caspase和jnk/sapk、p38 mapk與細胞凋亡［J］.國外醫學(衛生學分冊)，2008，35(1):5-10.

［7］Brnjic S，Olofsson M H，Havelka A M，et al.Chemical biology suggests a role for calcium signaling in mediating sustained JNK activation during apoptosis［J］.Mol Biosyst，2010，6(5):767-774.

［8］Bermudez O，Pages G，Gimond C.The dual-specificity MAP kinase phosphatases:critical roles in development and cancer［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2010，299(2):189-202.

［9］溫璟，鄭曉東，武峰，等.OK432-腫瘤疫苗對DBA/2小鼠外周血中T細胞亞群的影響［J］.中國醫藥導報，2013，10(11):16-18.

［10］戴衛紅，李云霞，孫成宏.高效液相色譜法測定芪芨散中黃芩苷的含量［J］.解放軍醫藥雜志，2014，26(5):79-81.

［11］Wu G S.Role of mitogen-activated protein kinase phosphatases(mkps)in cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2007，26(3-4):579-585.

［12］Li X J，Li B，Huang J S.Effects of acrylonitrile on lymphocyte lipid rafts and ras/raf/mapk/erk signaling pathways［J］.Genet Mol Res，2014，13(3):7747-7756.

［13］胡智，陶永光，唐發清，等.JNK相互作用蛋白通過JNK途徑影響鼻咽癌的增殖和凋亡［J］.生物化學與生物物理進展，2003，30(4):579-585.

［14］Choi H，Nguyen H N，Lamb F S.Inhibition of endocytosis exacerbates TNF-alpha-induced endothelial dysfunction via enhanced jnk and p38 activation［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2014，306(8):H1154-1163.

［15］Kitanaka C，Sato A，Okada M.Jnk signaling in the control of the tumor-initiating capacity associated with cancer stem cells［J］.Genes Cancer，2013，4(9-10):388-396.

［16］Sui X，Kong N，Ye L.P38 and jnk mapk pathways control the balance of apoptosis and autophagy in response to chemotherapeutic agents［J］.Cancer Lett，2014，344(2):174-179.

［17］Yeh Y T，Hou M F，Chung Y F，et al.Decreased expression of phosphorylated JNK in breast infiltrating ductal carcinoma is associated with a better overall survival［J］.Int J Cancer，2006，118(11):2678-2684.

［18］Brosseau C M，Pirianov G，Colston K W.Involvement of stress activated protein kinases(JNK and p38)in 1，25 dihydmxyvitamin D3-induced breast cell death［J］.Steroids，2010，75(13-14):1082-1088.

［19］延衛東，王瑞君，何琰，等.黃芩苷藥理作用研究進展［J］.陜西中醫，2002，23(12):1127-1129.

［20］Li B Q，Fu T，Dongyan Y，et al.Flavonoid baicalin inhibits HIV-1 infection at the level of viral entry［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，276(2):534-538.

［21］梁慧敏，時小燕，和振坤，等.黃芩苷誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡作用觀察［J］.實用肝臟病雜志，2012，15(4):343-345.

［22］Zheng Y，Zhang M，Zhao Y.Jnk inhibitor sp600125 protects against lipopolysaccharide-induced acute lung injury via upregulation of claudin-4［J］.Experimental and therapeutic medicine，2014，8(1):153-158.