Ku70蛋白在肝細胞癌患者體內的表達規律及其意義

楊成林，李俊杰，孫學軍

在世界范圍內肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)死亡率在腫瘤中列第3位［1］。提高早期診斷是提升HCC療效的關鍵。傳統的超聲、CT和MRI敏感性不夠或價格昂貴，無法準確或大規模應用于其早期診斷或預后判斷［2-3］。甲胎蛋白(a-Fetoprotein，AFP)是敏感性和特異性均較高的HCC血清標志物，但仍有30%患者血清AFP并未升高，因而臨床應用有局限性［4］。在非小細胞型肺癌、前列腺癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌、食管癌等組織及細胞系中，均發現有Ku70異常表達［5-13］。Ku80與乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)相關的HCC預后有密切關系［14-15］。但Ku70蛋白在HCC中的表達規律及其臨床意義相關報道較少。因此，本研究收集106例HCC手術切除標本，檢測Ku70蛋白在HCC患者體內的表達規律，并明確其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2005年1月—2011年5月我院手術治療的106例HCC手術切除標本及臨床資料。所有患者術后病理檢查均為原發性HCC，且手術切緣無殘存腫瘤細胞。其中男69例，女37例，年齡26～75(57.7±19.1)歲，中位年齡55歲。肝硬化98例、乙型病毒性肝炎95例、丙型病毒性肝炎7例、酒精性肝病4例;感染HBV時間49例＜10年，46例≥10年。肝癌分期I期34例，II期38例，III期27例，IV期7例。術前Child-Pugh分級A級66例，B級40例。病理高分化31例，中分化46例，低分化29例。隨機收集92例肝血管瘤手術時切取的正常肝組織作為正常對照組，其中男56例，女36例，年齡(53.1±22.6)歲。兩組患者的年齡及性別比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 標本收集與處理 通過肝癌根治術取癌組織和距離癌組織2 cm的癌旁組織。浸泡在4%甲醛溶液中固定24 h，而后常規石蠟包埋、切片，切片厚度4 μm。所有受試者均簽署書面知情同意書，并由醫院倫理委員會批準。

1.3 隨訪 隨訪采取門診復查或電話。隨訪截止日期為2014年6月30日。隨訪周期為2～88(47.3±31.5)個月，中位時間為42個月。失訪3例，其中男2例，女1例，均為HBV相關的HCC合并肝硬化。最終103例完成隨訪。每月檢查AFP水平;每6個月行腹部B超檢查。如果懷疑腫瘤復發，立即行CT和MRI檢查確診。

1.4 免疫組織化學染色及結果判定 以PBS代替一抗作為空白對照，以正常兔血清(武漢博士德生物工程有限公司)代替一抗作為陰性對照，采用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連接(SP)法染色。抗原修復液為0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)。切片常規脫蠟至水，3%H2O2－甲醇溶液浸泡10 min，抗原微波熱修復2～3次;山羊血清封閉10 min，加一抗(anti-Ku70單克隆抗體，美國Abcam公司)后置于4℃過夜;37℃復溫45 min后加入二抗，37℃下孵育30 min，DAB顯色5～10 min，蘇木精襯染后脫水、透明、封片;普通光鏡下觀察結果。由兩名高年資病理科醫師在不知道任何臨床和病理資料的情況下判讀結果。Ku70蛋白的陽性效應產物為定位于細胞核的棕黃色顆粒［7］，細胞質或細胞膜呈現為輕度或陰性免疫反應。每張切片隨機選擇5個高倍鏡視野，各計數100個細胞。觀察細胞著色程度，未染色計0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。計算陽性細胞的百分比，＜5%為0分，6% ～25%為1分，25% ～50%為2分，51% ～75%為3分，76% ～100%為4分。兩個得分相乘作為Ku70蛋白表達結果:陰性0分、弱陽性1～4分、陽性5～8分、強陽性9～12分，陽性率(%)=［1－(陰性表達例數/總例數)］×100%。根據最終的結果，定義0～4分低表達，5～12分高表達。

1.5 統計學分析 應用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩樣本之間的比較采用Student＇s t檢驗，計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。多因素分析采用非條件Logistic回歸分析。Kaplan-Meier法進行生存分析，組間比較采用log-rank檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 組織標本中Ku70蛋白的表達檢測結果Ku70蛋白的陽性表達信號主要位于細胞核，呈棕黃色顆粒狀，染色均勻一致。在肝癌組織中，Ku70蛋白的陰性表達率為9.7%(10例)，弱陽性表達率為27.2%(28 例)、陽性表達率為37.9%(39 例)、強陽性表達率為25.2%(26例)，總的陽性表達率為90.3%。癌旁組織中，Ku70蛋白的陰性、弱陽性、陽性及強陽性表達率分別為30.1%(31例)、31.1%(32 例)、24.3%(25 例)和 14.5%(15 例)，總的陽性表達率為69.9%。92例正常肝組織中，Ku70蛋白的陰性、弱陽性、陽性及強陽性表達率分別為31.5%(29 例)、35.9%(33 例)、22.8%(21 例)和9.8%(9例)，總的陽性表達率為68.5%。與正常肝組織比較，肝癌組織和癌旁組織中Ku70蛋白的陽性、強陽性和總的陽性表達率均顯著升高，差異具有統計學意義(P＜0.01)。與癌旁組織比較，肝癌組織中Ku70蛋白的陽性、強陽性和總的陽性表達率顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.2 肝癌組織中Ku70蛋白表達與臨床病理參數的關系 根據Ku70蛋白的表達情況，將103例HCC患者分為低表達組38例(36.9%)和高表達組65例(63.1%)。單因素分析表明，肝癌組織中Ku70蛋白的表達水平與Child-Pugh分級、腫瘤直徑、腫瘤分化程度及 TNM分期有關(P=0.021、0.039、0.017、0.008)，見表 1。將上述單因素分析中有統計學意義的指標進行非條件Logistic回歸分析。Y=0為Ku70低表達，Y=1為Ku70高表達。變量賦值如下:Child A級=0，Child B級=1;腫瘤大小:腫瘤直徑＜2 cm為1，2～5 cm為2，＞5 cm為3;腫瘤低分化=1，中分化=2，高分化=3;I期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期 =3，Ⅳ期 =4。結果表明，Child-Pugh分級、腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期是HCC患者肝癌組織中Ku70蛋白表達水平升高的危險因素，見表2。

2.3 Ku70蛋白的表達水平與生存情況的關系 低表達組生存時間為(40.3±4.6)個月，中位生存時間為33個月，3年生存率為47.4%，5年生存率為21.1%;高表達組生存時間為(30.8 ±2.6)個月，中位生存時間為25個月，3年生存率為27.7%，5年生存率為7.3%。與高表達組比較，低表達組患者的生存時間顯著延長(P＜0.05)。

表1 肝癌組織Ku70蛋白表達與臨床病理參數的關系(例)

表2 影響肝癌組織中Ku70蛋白表達水平危險因素的分析

3 討論

除AFP外，細胞間黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、γ-凝血酶原 (Desgamma carboxy-prothrombin，DCP)、人凝血酶原前體蛋白(Protein-induced vitamin K absence or antagonistII，PIVKA-II)、骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)等均被發現與HCC患者的預后有密切關系，但單獨應用時，敏感性和特異性仍較為有限［16-19］。在AFP的基礎上，聯合其他分子標志物檢測，是提高HCC診斷和預后判斷準確率的可行方法［20］。

Ku70在修復DNA并維持基因組穩定性中發揮重要作用。目前發現，Ku70的生物學功能十分復雜，參與多種基因的表達與調控，與腫瘤的形成有密切關系［21］。Hu等［7］發現在非小細胞肺癌組織中，Ku70的表達顯著升高;而高表達Ku70的患者，其臨床分期較晚，出現淋巴結轉移的比例較高，且生存時間較短。Alshareeda等［22］報道Ku70表達與乳腺癌患者較差的預后、較低的分化程度、淋巴結轉移呈正相關。Ku70與消化系統腫瘤也存在類似的關系。Gasinska等［8］發現Ku70與女性結腸癌患者的TNM分期有關，表達水平越高TNM分期越高。Li等［11］發現與正常胃組織相比，胃癌組織中Ku70的陽性表達率顯著升高。Sullivan等［12］發現在胰腺導管腺癌的腫瘤組織中，Ku70呈高表達趨勢，且通過RNA干擾下調Ku70的表達，可顯著降低胰腺導管腺癌細胞系 Mia PaCa-2的侵襲性。Yang等［13］發現Ku70與食管癌患者較差的預后、較高的TNM分期、較低的分化等級有直接關系;而在細胞水平中下調Ku70的表達，可促進細胞的凋亡。這些研究均表明，Ku70與消化系統腫瘤有著密切的聯系，其可能在腫瘤發生、發展中發揮類似原癌基因的功能。近期亦有研究表明，與Ku70共同組成Ku蛋白的另一條多肽鏈Ku80，與HBV和HCV相關的HCC患者預后有密切關系［14-15］。但Ku70蛋白在HCC中的表達規律及其臨床意義相關研究報道較少。

因此，本研究首先檢測HCC患者手術切除標本中Ku70蛋白的表達情況，以確定Ku70與HCC的關系。與已有文獻報道的結果相似，我們發現Ku70蛋白在肝癌組織中呈高表達趨勢，且陽性結果出現于癌細胞的細胞核中。生理情況下，Ku70在DNA的損傷修復起重要作用，維持基因組的穩定性;而在腫瘤的發展過程中，DNA復制往往出現損害，Ku70表達有可能出現反應性增高，在肝癌組織中表達升高，而在癌旁和正常肝組織中表達量較低甚至是陰性。在臨床病理指標檢測中，通過單因素和非條件Logistic統計分析，明確Ku70蛋白的表達增高，與術前較差的肝功能、較大的腫瘤直徑以及較高的TNM分期有關;而進一步的生存分析還表明，Ku70高表達的患者，其生存情況亦較差。至此初步明確Ku70蛋白的表達提示了HCC的惡性進展程度，與肝癌細胞的增殖可能有一定的相關性。

總之，本研究首次發現Ku70蛋白是HCC診斷的潛在腫瘤標志物，對接受手術治療的HCC患者的預后判斷有較好的應用價值，是一個具有良好潛在應用前景的分子標志物。

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