高血壓病血瘀證相關miRNA的篩選*

何鈴，方梅霞，陳利國△，袁靜，周建華，徐婧(暨南大學醫學院中醫系，實驗動物管理中心，廣東廣州5063)

高血壓病血瘀證相關miRNA的篩選*

何鈴1，方梅霞2，陳利國1△，袁靜1，周建華1，徐婧1
(暨南大學1醫學院中醫系，2實驗動物管理中心，廣東廣州510632)

目的:篩選與高血壓病血瘀證相關微小RNA(microRNA，miRNA)，從基因組學探索高血壓病血瘀證的發病機制。方法:運用高血壓病氣虛血瘀證、氣滯血瘀證、寒凝血瘀證、熱結血瘀證、非血瘀證患者和健康人的血清干預人臍靜脈血管內皮細胞CRL-1730，建立高血壓病血瘀證血管內皮細胞損傷模型;提取各組總RNA，采用Solexa高通量測序法和數字基因表達譜測序原理對各組樣本進行測序分析，篩選各組間的差異表達miRNA和mRNA，使用靶基因miRWalk預測軟件對2者進行相關性的整合，篩選與血瘀證相關miRNA，qRT-PCR定量分析驗證miRNA的表達。結果:整合氣虛血瘀組與非血瘀組、氣滯血瘀組與非血瘀組、寒凝血瘀組與非血瘀組、熱結血瘀組與非血瘀組相關數據后，在高表達的基因群中發現SAT1-Hsa-miR-199a-5p和ATF4-Hsa-miR-1283;qRT-PCR定量檢測Hsa-miR-199a-5p和Hsa-miR-1283在高血壓病血瘀證組和非血瘀證組中的上調與下調趨勢與基因測序結果一致。結論:Hsa-miR-199a-5p和Hsa-miR-1283可能是高血壓病血瘀證形成的特異性相關miRNA。

高血壓病;血瘀證;微小RNA

［ABSTRACT］AIM:To screen themiRNA related to blood stasis syndrome and to explore the geneticmechanism of blood stasis syndrome in hypertension.METHODS:Human umbilical vein endothelial cell line CRL-1730 was co-cultured with the human sera from healthy normal controls and hypertension patients to establish a blood stasis-hypertension cellmodela.The hypertension patients showed qideficiency and blood stasis，qistagnation and blood stasis，cold retaining and blood stasis，heat retaining and blood stasis and non-blood stasis syndromes.The endothelial cellmodels of blood stasis in hypertension were established.Target cells were collected for total RNA extraction.The techniques of Solexa(highthroughput sequencing method)and digital gene expression profiling were applied for screening the targetmiRNA，and miRWalk software was used for online prediction themRNA whichmight be the relevant target.qRT-PCR was conducted to confirm the prediction.RESULTS:SAT1-Hsa-miR-199a-5p and ATF4-Hsa-miR-1283 were found to be highly expressed in these cellmodels.The expression ofmiR-1283 and miR-199a-5p was confirmed by qRT-PCR.CONCLUSION:miR-199a-5p and miR-1283 may be the relevantmiRNA for the prediction of blood stasis syndrome in hypertension.

［KEY WORDS］Hypertension;Blood stasis syndrome;MicroRNA

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為21～24 nt的小分子單鏈非編碼RNA(non-conding RNA，ncRNA)，能夠和互補或者部分互補的靶基因mRNA的3’UTR結合，引起mRNA降解或介導其翻譯抑制［1］。這類小RNA在進化上具有高度的保守性，在表達上具有時間和組織特異性，是調節其它功能基因表達的重要調節分子，在生物體的各種生命過程中發揮著重要作用［2］。

根據血瘀證形成機理復雜、受多種因素影響的病因病機特點，以及血瘀證各型有其共同病理生理特點的研究結果，結合最近關于miRNA被發現在心血管系統疾病中具有重要作用［3］、某些特異性的miRNA能調節血管內皮細胞功能等研究成果，我們利用已建立的病證結合血瘀證血管內皮細胞損傷模型，采用Solexa和數字基因表達譜(digital gene expression profiling，DGE)測序原理對臨床上的高血壓病氣虛血瘀證(qi deficiency and blood stasis，QDBS)、氣滯血瘀證(qi stagnation and blood stasis，QSBS)、寒凝血瘀證(cold retaining and blood stasis，CBS)、熱結血瘀證(heat retaining and blood stasis，HBS)、非血瘀證(non-blood stasis，NBS)患者及健康人對照(normal control，NC)血清干預人臍靜脈血管內皮細胞進行miRNA測序分析，篩選與高血壓病血瘀證相關的miRNA，從中挖掘出在高血壓病血瘀證形成過程中起作用的miRNA，從miRNA方面來研究高血壓病血瘀證的發病機制。

材料和方法

1細胞模型的建立

1.1收集血清2011年12月至2012年6月期間，在廣州醫科大學附屬第二醫院確診者中收集到高血壓病血瘀證和高血壓病非血瘀證患者52例。以上患者均為原發性高血壓病患者，診斷符合《1999年世界衛生組織/國際高血壓聯盟關于高血壓治療指南》中“高血壓病”診斷標準;血瘀證患者診斷參照2011年修訂的血瘀證診斷標準;排除有靶器官損害或糖尿病。2組患者的血壓分級、性別分布、血壓和年齡差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性(表1)。暨南大學醫學院中醫系一年級本科生健康志愿者30人作為正常對照組?；颊呓M及對照組均空腹取血，采血前均未使用任何藥物，無菌采集前臂靜脈血入無菌帶帽不抗凝干燥試管，自凝后4℃、2 000 r/min離心15 min，取上清液置無菌EP管，56℃滅活30 min，凍存于－20℃備用。

表1　52例高血壓病患者基本情況Table 1.The basic situation of the 52 cases of patients with hypertension(Mean±SD)

1.2細胞培養將人臍靜脈內皮細胞株CRL-1730，按1×108/L，接種于25 mL培養瓶，每瓶4 mL，用含10%胎牛血清的完全培養基培養24 h后，換無血清培養液再培養24 h后，分別以高血壓病氣虛血瘀組、氣滯血瘀組、寒凝血瘀組、熱結血瘀組、高血壓病非血瘀組和正常組病人的血清進行繼續培養24 h，建立高血壓病氣虛血瘀組、氣滯血瘀組、寒凝血瘀組、熱結血瘀組、高血壓病非血瘀組和正常組6個分組的細胞模型。收集細胞，并用Trizol(Invitrogen)抽提總RNA。

2差異mRNA及m iRNA篩選

Illumina測序基于HiSeq 2000而屬于配對末端測序，簡化為PE測序，通過cDNA庫產生的片段進行測序，分別從5’和3’造成的配對末端讀取，定義為read 1和read 2。為方便測序數據的分析、發布和共享，Illumina HiSeq 2000測序得到的原始圖像數據經過Base Calling轉化為序列數據，即FASTQ格式，得到最原始的測序數據。DGE測序使用二代基因Illumina測序技術，由上海美吉生物科技有限公司完成。測序完成后則對原始統計數據進行質量評估，保留高質量的序列，并與人類基因組序列比較。根據比較結果，統計每個樣本轉錄的FPKM值。最后對所有轉錄基因的表達量進行組間差異顯著表達分析，按照差異基因的篩選條件，當P＜0.01、FDR＜0.001且|log2ratio|≥1即達到極顯著差異的水平，可認為找到表達顯著差異的相關篩選基因。

3整合分析差異表達的m iRNA和mRNA

利用靶基因在線預測軟件miRWalk(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/predictedmirnagene.html)預測各差異表達的mRNA可能結合的miRNA，同時考慮mRNA與miRNA表達量上的反比關系，將氣虛血瘀組與非血瘀組、氣滯血瘀組與非血瘀組、寒凝血瘀組與非血瘀組、熱結血瘀組與非血瘀組4組中共有的差異表達mRNA和miRNA進行結合篩選。

4qRT-PCR驗證

為了驗證基因表達譜測序的可靠性，實驗利用qRT-PCR技術，選擇測序結果表達量較高，差異比較顯著的2個miRNA，用qRT-PCR試劑盒檢測其表達量，采用2－ΔΔCt法進行數據統計分析。最后將結果進行log2ratio計算。

5統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，組間均數資料采用t檢驗，各組間均數資料采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1測序原始數據量統計及質量分析結果

測序得到的原始圖像數據經過Base Calling轉化為FASTQ文件，文件包含測序序列的序列信息以及reads的測序質量信息。對測序后得到的原始數據進行質控作圖，原始數據堿基分布圖見圖1、2;為保證后續生物信息分析的質量，對原始序列進行一系列過濾以去除雜質數據，得到干凈高質量的序列。本文在此基礎上進行分析。

Figure 1.Base distribution map of the original data.圖1　原始數據的堿基分布圖

2血瘀證差異表達的m iRNA的篩選結果

利用Solexa測序原理對以上6組樣本進行miRNA測序分析，分析樣本中各miRNA的表達量，結果顯示:(1)氣虛血瘀組與正常組:共檢測到miRNA976個，其中差異表達的miRNA有580個(P＜0.05)，表達下調的miRNA 227個，表達上調的miRNA 353個;(2)氣滯血瘀組與正常組:共檢測到miRNA 979個，其中差異表達的miRNA有576個，表達下調的miRNA 249個，表達上調的miRNA 327個; (3)寒凝血瘀組與正常組:共檢測到miRNA 973個，其中差異表達的miRNA有620個，表達下調的miRNA 176個，表達上調的miRNA 444個;(4)熱結血瘀組與正常組:共檢測到miRNA 1 077個，其中差異表達的miRNA有535個，表達下調的miRNA 203個，表達上調的miRNA 332個;(5)氣虛血瘀組與非血瘀組:共檢測到miRNA974個，其中差異表達的miRNA有624個，表達下調的miRNA 271個，表達上調的miRNA 353個;(6)氣滯血瘀組與非血瘀組:共檢測到miRNA 978個，其中差異表達的miRNA有607個，表達下調的miRNA 268個，表達上調的miRNA339個;(7)寒凝血瘀組與非血瘀組:共檢測到miRNA 972個，其中差異表達的miRNA有659個，表達個，其中差異表達的miRNA有585個，表達下調的miRNA 243個，表達上調的miRNA 342個;(9)非血瘀組與正常組:共檢測到miRNA 890個，其中差異表達的miRNA 668個，表達下調的miRNA 324個，表達上調的miRNA 344個，見圖3。

Figure 2.Mass distribution of the original data.圖2　原始數據的堿基質量分布圖

Figure 3.The number of differentially expressed miRNA.圖3　差異表達的m iRNA數量

3各血瘀證組與正常對照組及非血瘀證組差異表達m iRNA的整合分析

整合分析各個血瘀證組與正常組及非血瘀證組的差異表達的miRNA，結果顯示:(1)既在氣虛血瘀組與正常組中差異表達又在氣虛血瘀組與非血瘀組中差異表達的miRNA有383個，其中下調152個，上調231個;(2)既在氣滯血瘀組與正常組中差異表達又在氣滯血瘀組與非血瘀組中差異表達的miRNA有380個，其中下調154個，上調226個; (3)既在寒凝血瘀組與正常組中差異表達又在寒凝血瘀組與非血瘀組中差異表達的miRNA有455個，其中下調131個，上調324個;(4)既在熱結血瘀組與正常組中差異表達又在熱結血瘀組與非血瘀組中差異表達的miRNA有359個，其中下調134個，上調225個，見表2。

4血瘀證特有m RNA和m iRNA的整合篩選

整合氣虛血瘀組與非血瘀組、氣滯血瘀組與非血瘀組、寒凝血瘀組與非血瘀組、熱結血瘀組與非血瘀組4組差異表達基因的結果發現:共同存在的差異表達基因301個，共同存在的差異表達的miRNA共300個。利用miRWalk軟件在線預測各差異表達的mRNA可能結合的miRNA，同時考慮表達量上的反比關系，將4組中共有的差異表達mRNA和miRNA進行結合篩選，結果在高表達的基因群中發現SAT1-Hsa-miR-199a-5p和ATF4-Hsa-miR-1283。

5qRT-PCR驗證m iR-1283和m iR-199a-5p在高血壓病血瘀證的表達量

qRT-PCR結果顯示，miR-1283和miR-199a-5p在各血瘀證組中顯著低于非血瘀證組，且與測序結果趨勢基本一致，說明測序結果是可信的，見圖4。

表2　整合各血瘀證組與正常及非血瘀證組的差異表達m iRNA情況Table 2.The integration of the number of differentially expressed miRNA in blood stasis groups，NC group and NBS group

Figure 4.Gene expression ratio detected by DGE sequencing and qRT-PCR.圖4　DGE測序與定量PCR檢測基因表達量的比對

6高血壓病血瘀證組與正常及非血瘀證組m iR-1283和m iR-199a-5p的qRT-PCR表達量

qRT-PCR實驗結果顯示，與高血壓病非血瘀證組比較，各高血壓病血瘀證組miR-1283的表達量明顯降低(P＜0.05);與高血壓病非血瘀證組比較，高血壓病氣虛血瘀證組、氣滯血瘀證組和寒凝血瘀證組miR-199a-5p的表達量明顯降低(P＜0.01或P＜0.05);而高血壓病熱結血瘀證組miR-199a-5p表達量下降不明顯(P＞0.05);正常組與非血瘀證組比較miR-1283及miR-199a-5p的表達量均升高不顯著(P＞0.05)，見表3。

表3　各高血壓病血瘀證組與正常及非血瘀證組m iR-1283和m iR-199a-5p的表達量Table 3.The relative expression levels of miR-1283 and miR-199a-5p in blood stasis groups，NC group and NBS group(Mean±SD.n=3)

討論

原發性高血壓(essentialhypertension)又稱高血壓病，是臨床最為常見的心血管疾病。中醫認為血瘀是高血壓病的重要病因之一，在高血壓病的發生和發展過程中起重要作用。

近年來越來越多的研究發現，miRNA參與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、心肌肥厚、心律失常等心臟疾病的發生、發展機制［4］，在心血管系統疾病及微血管病變中具有重要作用［5］。miRNA作為細胞內的調節因子，參與生長發育、分化、細胞凋亡、代謝等過程，它可以在轉錄水平和轉錄后水平上影響功能基因的表達豐度，據推測人類基因組中有約1/3的基因受microRNA調控［6］，有研究發現，miR-1283靶基因與細胞浸潤、增殖及凋亡有關［7-10］。鄭丹鳳等［11］的研究發現，miR-1283高表達可以抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖及浸潤，促進凋亡。張振輝等［12］研究發現miR-199a-5p在心肌肥大動物和細胞模型中表達量發生上調，miR-199a-5p過表達能促進體外培養的心肌細胞肥大，而阻遏miR-199a-5p的作用能抑制Ang II誘導的心肌細胞肥大。且有研究顯示，miR-199a-5p與冠心病血瘀證有關，這與其可能會減輕炎癥和凋亡有關［13］。ATF4(activating tran-scription factor 4)是一種激活轉錄因子。研究認為，ATF4表達的增加是內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的重要標志，是ERS致凋亡的關鍵分子［14］，ERS是導致心腦組織缺血梗塞、神經退行性疾病等發生的重要環節［15］，廣泛參與多種慢性疾病的發生與發展。內質網是細胞內蛋白質合成折疊、Ca2+儲存和脂質合成的重要部位。內質網穩態的破壞導致大量錯誤或者未折疊蛋白質在內質網中的聚集，通過相應的信號通路，引起一系列的細胞反應，即ERS。ERS是心血管疾病(高血壓心肌肥厚、動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、糖尿病性心肌病等)發病的重要細胞分子機制、亦是心血管疾病治療的新靶點，受到高度關注。SAT1基因編碼的蛋白質屬于乙酰轉移酶家族，是一個速率限制的多胺代謝酶。催化亞精胺和精胺的乙?；?，并參與細胞內的多胺含量和運輸的細胞的調節。目前有研究發現SAT1參與細胞的損傷與應激，當存在一些應激因素(如中毒、感染及缺氧)時，SAT1的活性會反射性的增高。根據血瘀證形成機理復雜、受多種因素影響的病因病機特點，以及血瘀證各型有其共同病理生理特點的研究結果，我們認為，使用Solexa等技術，獲取并鑒定損傷后的血管內皮細胞中與血瘀證各型相關的miRNA，具有篩選和發現與血瘀證相關的生物標志物的可能性，能夠顯示出在血瘀證診斷和治療中的獨特價值。

本課題通過基因芯片技術篩選發現高血壓病各型血瘀證、非血瘀證患者之間miRNA存在顯著差異，提示高血壓病血瘀證的發病與miRNA相關;且結果顯示高表達的基因群中SAT1-Hsa-miR-199a-5p和ATF4-Hsa-miR-1283在血瘀證各組和非血瘀證組中表達量具有顯著差異，提示miR-199a-5p和miR-1283可能為高血壓病血瘀證相關的特異性miRNA。對于這2個miRNA的具體調控機制還有待我們進一步的細胞和動物實驗進行研究驗證。

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Screening of hypertension/blood stasis syndrome-related m iRNA in endothelial cellmodels

HE Ling1，FANGMei-xia2，CHEN Li-guo1，YUAN Jing1，ZHOU Jian-hua1，XU Jing1
(1Department of Traditional Chinese Medicine，School of Medicine，2Institute of Laboratory Animal Science，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:tchenly@jnu.edu.cn)

R259.441

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.009

1000-4718(2015)05-0817-06

2014-10-22［修回日期］2015-01-21

國家自然科學基金資助項目(No.81173157);廣東省自然科學基金資助項目(No.10151063201000045)

Tel:020-85226476;E-mail:tchenly@jnu.edu.cn