同源異型盒基因5 在急性髓細胞性白血病中表達的研究

李麗麗 夏瑞祥

急性髓細胞性白血病(acute meloid leukemia，AML)是一類造血系統的惡性克隆性疾病，為最常見的成人血液惡性腫瘤。影響AML 預后重要因素是細胞遺傳學，但仍有40%～45%正常核型AML 的治療反應、長期生存情況差異明顯。隨著髓細胞白血病的分子生物學研究進展，發現一些基因表達異常或突變，如ERG、MN1、FLT3-ITD 及NPM1 等對AML 的發生、發展及預后有著重要影響［1，2］。同源異型盒基因5(Homeobox gene 5，HOXA5)是一種轉錄因子，其與AML存在關聯。本研究使用熒光定量聚合酶鏈式反應(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RTQ-PCR)對成人AML 中的HOXA5 表達情況進行研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2009 年12 月至2011 年2 月我院初診成人AML 患者108 例，正常對照為10 例同期門診患者(白細胞減少癥、脾功能亢進、缺鐵性貧血)。初診成人AML 患者均使用IA(3+7)或DA(3+7)標準誘導方案治療，化療1 個療程后復查骨髓判斷療效。108 例AML 患者中，原發性AML 97 例、繼發性AML 11 例(9例骨髓增生異常綜合征化的AML，2 例慢性粒細胞白血病急變的AML);標準方案誘導治療AML 共92 例，未治療16 例;初次誘導治療完全緩解(complete response 1，CR1)57 例，未完全緩解(no response 1，NR1)35 例;年齡≥60 歲18 例，年齡＜60 歲90 例;男性64 例，女性44例。所有初診成人AML 患者診斷及分型均符合張之南主編的《血液病診斷及療效標準》［3］。

1.2 方法使用RTQ-PCR 檢測骨髓HOXA5 表達量。

1.2.1 標本制備 Ficoll 分離法提取2 mL EDTA 抗凝骨髓中的單個核細胞，保存在-80℃中備用。

1.2.2 RTQ-PCR 在單個核細胞中抽提RNA 并測量其濃度。取1 μg RNA 反轉錄成cDNA，以ABL 為內參基因，取1 μL cDNA 以95℃預變性2 min，95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，共40 個循環;72℃延伸7 min 為擴增條件，HOXA5 的引物序列為F5'-AGATCTACCCCTGGATGCGC-3'、 R5'- CCTTCTCCAGCTCCAGGGTC-3'進行普通PCR 擴增，其擬擴增產物大小為212 bp。取5 μL 擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，條帶與理論值相同且清晰單一。2 次引物驗證均成功后，取引物1 μL(上下游)、Real-Time PCR 儀中先后加入2 μL cDNA、6.6 μL DEPC 水、10 μL SYBR Green 經95℃20 s 預變性，95℃3 s、60℃30 s，共36個循環;95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s，得出溶解曲線。溶解曲線單一峰型，溶解溫度與驗證時相近，復孔CT 值標準差≤0.2;陰性對照沒有起峰，或溶解曲線峰型比較雜亂，且CT 值超過35。

1.3 統計學方法采用SPSS 16.0 進行統計分析，計量資料呈非正態分布，組間比較使用非參數檢驗，計數資料統計分析使用χ2檢驗，計數資料相關性使用Spearman 相關性分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RTQ-PCR 檢測結果檢測出數據為HOXA5 表達量，Realtime PCR 產物溶解曲線圖見圖1、圖2，擴增產物電泳圖見圖3。

2.2 HOXA5 在AML 與正常人中的表達初診AML與正常對照的HOXA5 表達量經正態分布檢驗后不符正態分布，初診AML 與正常對照人群的HOXA5 進行比較，差異無統計學意義(Z=0.68，P=0.40)。

2.3 AML 患者HOXA5 表達的ROC 曲線108 例AML 的HOXA5 表達情況繪制ROC 曲線見圖4，AUC=0.57，P=0.50。以cut-off=2.70 為界，HOXA5高表達39 例，低表達69 例。

2.4 HOXA5 表達與AML 病因的關系原發性AML患者中，HOXA5 高表達34 例、低表達63 例;繼發性AML 患者中，HOXA5 高表達5 例、低表達6 例。原發性與繼發性AML 患者的HOXA5 表達差異無統計學意義(P=0.50)，見表1。

2.5 HOXA5 表達與初次誘導治療緩解的關系CR1患者中，HOXA5 高表達15 例、低表達42 例;NR1 患者中，HOXA5 高表達21 例，低表達14 例。CR1 與NR1患者的HOXA5 表達差異有統計學意義(P=0.00)，見表1。

2.6 HOXA5 表達與年齡的關系年齡≥60 歲患者中，HOXA5 高表達4 例、低表達14 例;年齡＜60 歲患者中，HOXA5 高表達35 例、低表達55 例。年齡≥60歲與＜60 歲AML 患者的HOXA5 表達差異無統計學意義(P=0.18)，見表1。

2.7 HOXA5 表達與性別的關系男性AML 患者64例，其中HOXA5 高表達11 例、低表達46 例;女性AML 患者44 例，其中HOXA5 高表達21 例、低表達23例。不同性別AML 患者的HOXA5 表達差異有統計學意義(P=0.01)，見表1。

表1 AML 患者HOXA5 表達情況

2.8 HOXA5 表達與各因素相關性HOXA5 表達與CD34、HLA-DR、CD33、WBC 計數、LDH 無相關性(P ＞0.05)，而HOXA5 與骨髓原始細胞數有相關性(P ＜0.05)，見表2。

3 討論

AML 是一組異質性疾病，其發病與多種因素相關，伴隨臨床特征、治療反應及長期生存的很大差異。隨著研究深入，病因、年齡、FAB 分型、免疫學等明確是影響AML 預后因素［4］，一些細胞遺傳學及分子生物學改變的可成為最重要影響因素，甚至是獨立預后因素。

同源異型盒基因是定位于脊椎動物的第2(2q31)、7(7p15.3)、12(17p21.3)、17(12q13.3)染色體上轉錄因子家族成員，調控著胚胎發育和造血干細胞分化［5］。在結腸直腸癌、宮頸癌、神經系統腫瘤等多種腫瘤組織中異常表達。國外研究［6］證實同源異型基因通過造血干細胞增殖、分化及凋亡參與惡性血液腫瘤發生發展過程并與其預后密切相關。

同源異型基因家族成員中，在胚胎發育和干細胞分化發揮關鍵作用是HOXA5 基因，它定位于第7 號染色體上。HOXA5 基因可通過激活p53 依賴途徑誘導乳腺癌細胞凋亡，其低表達可能誘發乳腺癌的發生［7］，說明HOXA5 對實體腫瘤的發生是有一定作用的，也可能在血液腫瘤的發生中起著作用。

本研究中AML 患者與正常對照的HOXA5 表達無明顯差異，但這不能說明HOXA5 與AML 的發病沒有相關性。已有研究［8］證實HOXA5 基因與某些染色體易位的關聯作用可以影響白血病的發生發展，更是髓系干細胞分化的關鍵調節因素。但需要進一步研究HOXA5 與哪些染色體存在何種易位失聯作用，而對AML 的發生產生作用，證實HOXA5 與AML 發生是否存在相關性。

Drabkin 等［9］研究表明HOXA5 基因高表達，預示著AML 和混合表型白血病不良預后。HOXA5 基因表達高低是AML 預后的影響因素之一，其高表達則有著較差預后［10］。且已有研究提出HOXA5 異常表達可能影響AML 預后［11］。

本文標準方案初次誘導治療CR1 患者中，HOXA5高表達15 例、低表達42 例;NR1 的AML 中，HOXA5高表達21 例、低表達14 例。HOXA5 高表達者有著較低緩解率，這說明HOXA5 表達可能影響AML 對治療的反應，高表達可能預示著較低緩解率。原發性與繼發性AML、年齡≥60 歲與＜60 歲AML 患者的HOXA5表達無統計學意義，說明HOXA5 表達與病因及年齡可能無明顯相關。而男性AML 中HOXA5 高表達11例、低表達46 例;女性中HOXA5 高表達21 例、低表達23 例，男性與女性AML 的HOXA5 表達差異有統計學意義，說明HOXA5 在男性AML 患者中表達低，但需進一步擴大樣本量驗證。對初診成人AML 患者的HOXA5 表達繪制ROC 曲線，提示HOXA5 有較低準確性，其表達對AML 治療療效或者預后可能存在提示意義，需進一步擴大樣本量檢測HOXA5 表達。HOXA5表達與CD34、HLA-DR、CD33、WBC 數及LDH 均無相關性，說明HOXA5 與初診AML 的一些臨床特征無關聯。但HOXA5 與骨髓原始細胞數有相關性，說明HOXA5 表達與骨髓原始細胞數成正相關，骨髓原始細胞數高可能增加了化療風險，療效減低，這可能亦與AML 較低緩解率有關。

［1］ Hou HA，Lin CC，Chou WC.Integration of cytogenetic and molecular alterations in risk stratification of 318 patients with denovo non-M3 acute myeloid leukemia［J］.Leukemia，2014，28(1):50－58.

［2］ 李麗麗，夏瑞祥.腦膜瘤1 基因在216 例成人急性髓細胞性白血病中的表達及意義［J］.安徽醫科大學學報，2012，(6):694－698.

［3］ 張之南，沈銻.血液病診斷及療效標準［M］.2 版.北京:科學出版社，1998:172－173，214－216.

［4］ 嚴紅.急性白血病緩解率、早期死亡相關因素分析［J］.安徽醫學，2005，26(4):309－311.

［5］ Spencer DH，Young MA，Lamprecht TL，et al.Epigenomic analysis of the HOX gene loci reveals mechanisms that may control canonical expression patterns in AML and normal hematopoietic cells［J］.Leukemia，2015，29(6):10－14.

［6］ Golub TR，Slonim DK，Tamayo P，et al.Molecular classification of cancer:class discovery and class prediction by gene expression monitoring［J］.Science，1999，286(5439):531－537.

［7］ Raman V，Tamori A，Vali M，et al.HOXA5 regulates expression of the progesterone receptor［J］. J Biol Chem，2000，275(34):26551－26555.

［8］ Boucherat O，Guillou F，Aubin J，et al.Hoxa5:a master gene with multifaceted roles［J］.Med Sci，2009，25(1):77－82.

［9］ Drabkin HA，Parsy C，Ferguson K，et al.Quantitative HOX expression in chromosomally defined subsets of acute myelogenous leukemia［J］.Leukemia，2002，16(2):186－195.

［10］Peng Zh，Li T.Aberrant expression of HOXA5 and HOXA9 in AML［J］.Leukemia，2003，44(11):1935－1941.