前列腺癌及其癌旁組織中受體酪氨酸激酶的磷酸化分析

黃 滔張 卿馬斌斌劉景麗劉建河

楚晨龍1王名偉1嚴 磊2周文龍4*俞 強2*

1. 瑞金醫院盧灣分院泌尿外科（上海 200020）;

2. 中國科學院上海藥物研究所; 3. 新華醫院泌尿外科; 4. 瑞金醫院泌尿外科

前列腺癌及其癌旁組織中受體酪氨酸激酶的磷酸化分析

黃 滔1△張 卿2△馬斌斌1劉景麗2劉建河3

楚晨龍1王名偉1嚴 磊2周文龍4*俞 強2*

1. 瑞金醫院盧灣分院泌尿外科（上海 200020）;

2. 中國科學院上海藥物研究所; 3. 新華醫院泌尿外科; 4. 瑞金醫院泌尿外科

目的 檢測前列腺癌受體酪氨酸激酶（RTK）的表達和活化，探討前列腺癌生物標志物及可能的藥物靶點。方法 利用RTKs芯片來檢測一例前列腺癌患者腫瘤組織及癌旁組織中49種RTKs的磷酸化水平。結果 發現前列腺癌患者的癌組織中EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Insulin R、Axl、PDGFRα、PDGFRβ、M-CSFR、VEGFR2的磷酸化均高于癌旁組織。結論 前列腺癌患者的癌組織中EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Insulin R、Axl、PDGFRα、PDGFRβ、M-CSFR、VEGFR2可能參與了腫瘤的形成和生長。

前列腺腫瘤; 受體酪氨酸激酶

蛋白酪氨酸激酶是調控細胞生長和分化的重要分子，它們在腫瘤的發生發展中起著重要的作用，是癌轉移和產生治療抵抗性等生物學特性的信號級聯反應的關鍵。我們利用蛋白磷酸化芯片檢測了一例前列腺癌患者癌組織和癌旁組織中49個受體酪氨酸激酶的磷酸化水平，以期了解受體酪氨酸激酶（RTK）磷酸化和前列腺癌發生發展的關系，為臨床上針對酪氨酸激酶的靶點藥物治療提供參考。

材料和方法

一、臨床資料

患者，男，69歲。體檢發現其血液中PSA值升高為8.2ng/mL。行經會陰B超定位下前列腺穿刺活檢，病理診斷為：前列腺癌，gleason7分（3+4）。經術前準備2周后行腹腔鏡前列腺癌根治術。術中取前列腺癌標本及癌旁正常組織各一塊。術后病理診斷為：前列腺癌，gleason7分（3+4）。

二、實驗方法

1. 蛋白樣品的制備：取新鮮前列腺癌及癌旁組織塊，稱量，按比例加入組織裂解液（試劑盒中提供），置冰上裂解。后置4℃離心機中，1400×g，離心5min，吸取上清。BCA法檢測蛋白含量，備用。

2. 蛋白芯片膜的封閉：將蛋白芯片膜浸在封閉液中，室溫封閉1h。

3. 免疫反應：將細胞裂解液蛋白樣品加載至蛋白芯片膜上，置搖床上孵育過夜，以適量洗液在室溫下洗滌后，加二抗室溫下孵育2h后，以適量洗液洗滌。

4. 化學發光、顯影。

結 果

一、前列腺癌和癌旁組織的HE染色結果

由圖1A見：前列腺癌組織，為腺體密集，癌細胞體積較小，核深染，上皮細胞呈多層排列不規則，可見間質浸潤。前列腺癌旁組織為正常前列腺組織（由圖1B）。

圖1 前列腺癌和癌旁組織的HE染色

二、前列腺癌和癌旁組織的49個酪氨酸激酶磷酸化水平檢測

在所檢測的49個RTK中，EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Insulin R、Axl、PDGFRα、PDGFRβ、M-CSFR、VEGFR2在前列腺癌組織中的磷酸化均高于癌旁組織，這些激酶分屬于EGFR、Insulin R、Axl、PDGFR和VEGFR家族。其中，EGFR、Axl、PDGFRβ在前列腺癌旁組織中也有少量磷酸化，見圖2。

討 論

前列腺癌是一種老年男性高發疾病，是發生在男性前列腺的上皮惡性腫瘤，全球每年約有20萬患者死于前列腺癌。在西方國家，前列腺癌是男性第二大惡性腫瘤，僅次于肺癌。我國前列腺癌病率也逐年上升，已居泌尿系腫瘤的第3位，并且發病年齡也趨年輕化。前列腺癌初期多為雄激素依賴型，所以治療以手術去勢和藥物去勢作為重要手段，但是在治療后，幾乎全部的患者會發展為雄激素非依賴型前列腺癌（AIPC），導致去勢治療抵抗。因此闡明前列腺癌發生發展的機制，尤其是前列腺癌非雄激素依賴生長的分子機理，是臨床需要解決的重要科學問題。目前前列腺癌由雄激素依賴性向雄激素非依賴性轉變的機制尚不十分清楚，對雄激素非依賴型前列腺癌一直缺乏有效的治療措施。對細胞生長信號通路的深入研究發現不依賴雄激素而通過RTK信號傳導通路激活雄激素受體（AR）的活性。越來越多的研究也證實RTK信號通路通過調節AR的活性在前列腺癌進展中起重要的作用。

圖2 前列腺癌及癌旁組織49個酪氨酸激酶的相對磷酸化水平

蛋白酪氨酸激酶是調控細胞生長和分化的重要分子，它們在腫瘤的發生發展中起著重要的作用。人的基因組中共有90個RTK基因，其中有58個基因編碼跨膜的RTK[1]。受體與配體結合后激活受體的酪氨酸蛋白激酶活性，產生一系列蛋白磷酸化級聯反應，引起細胞基因表達的改變，參與細胞的生長和生存調控。在腫瘤細胞中，RTK多表現為異常表達和活化[2]。

2010年Dai等[3]應用免疫組織化學的方法對包含112例人前列腺癌標本的組織芯片進行RTK Etk（多個RTK受體中的一個）表達研究，發現在激素抵抗性前列腺癌中Etk表達增高與AR酪氨酸殘基的磷酸化密切相關，認為Etk可能是雄激素剝奪條件下AR激活的補償機制的重要組成部分，至少一部分可以通過直接調節AR信號通路，在激素抵抗性前列腺癌形成中起一定的作用。Mahajan等[4]研究表明：酪氨酸殘基磷酸化的AR蛋白在AIPC組織中的表達與酪氨酸殘基磷酸化的Ack1表達也相一致，提示由Her2 RTK激活所激發的Ack1的活化能提高AR的激活從而促進前列腺癌的疾病進展。這些研究表明RTK信號傳導系統在AIPC的發生過程中起著重要的作用，也證明了RTK在AIPC的發生及治療中的重要價值。

研究也發現一些RTK在前列腺癌組織中表達或活化異常，或者在去勢治療過程中，某些RTK表達增加，如EGFR、EphA、Axl、PDGFR、IGF-IR、VEGFR、FGFR、Met等[5-10]，導致下游信號通路持續激活，參與腫瘤細胞的增殖、轉移和血管的增生。我們利用蛋白芯片，檢測了一例前列腺癌患者的癌組織和癌旁組織中RTK的磷酸化水平，發現EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Insulin R、Axl、PDGFRα、PDGFRβ、M-CSFR、VEGFR2在前列腺癌組織中的磷酸化均高于癌旁組織，說明其相應的信號通路處于激活狀態，可能參與了腫瘤的形成和生長[11, 12]。

針對持續激活的RTK，可以采用激酶抑制劑進行相應的治療。目前，臨床上已經在嘗試用上市的酪氨酸激酶抑制劑如Sunitinib、Sorafenib、Cabozantinib等[1314]與常規的前列腺癌治療方法聯合來治療患者。而酪氨酸激酶抑制劑治療腫瘤患者是否有效，取決于腫瘤組織中特定激酶的表達和活化是否增高，因此必須針對活化的RTK進行個體化治療。我們用蛋白芯片檢測腫瘤組織中RTK的活化狀況，為臨床上激酶抑制劑的選擇和應用提供了依據。

本研究利用受體酪氨酸激酶芯片檢測前列腺癌患者腫瘤組織及癌旁組織中49種受體酪氨酸激酶的磷酸化水平，發現癌組織中EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Insulin R、Axl、PDGFRα、PDGFRβ、M-CSFR、VEGFR2可能參與了腫瘤的形成和生長。因受資金限制，只成功檢測了一例患者，與自身正常組織對照。今后要進一步運用蛋白芯片對多例前列腺癌標本進行檢測，并以動物實驗模型驗證相關結果，這將有助于深入研究前列腺癌受體酪氨酸激酶的表達和活化，可以準確地尋找前列腺癌生物標志物及藥物靶點，從而將靶向藥物應用于臨床治療前列腺癌。

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14 Vaishampayan UN. Development of cabozantinib for the treatment of prostate cancer. Core Evid 2014; 9: 61-67

（2015-03-18收稿）

Expression analysis of receptor tyrosine kinase phosphorylation in a prostate cancer tissue and its para-carcinoma tissue

Huang Tao1△, Zhang Qing2△, Ma Binbin1, Liu Jingli2, Liu Jianhe3, Chu Chenlong1,Wang Mingwei1, Yan Lei2, Zhou Wenlong4*, Yu Qiang2*
1. Department of Urology, Luwan Branch of the Ruijin Hospital, Shanghai 200020, China;
2. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences; 3. Department Urology of the Xinhua Hospital; 4. Department Urology of the Ruijin Hospital Corresponding author: Zhou Wenlong , E-mail: zhouwenlong6063@sina.com; Yu Qiang, E-mail: qyu@sibs.ac.cn

Objective To detect the expression and activation of receptor tyrosine kinases (RTKs) in prostate cancer tissue, and explore potential biomarkers and drug targets for prostate cancer. Methods The phosphorylation levels of 49 types of receptor tyrosine kinase in a prostate cancer tissue and its para-carcinoma tissue were examined by RTK microarray. Results The phosphorylation expressions of EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, Insulin R, Axl, PDGFRα, PDGFRβ, M-CSFR, VEGFR2 were all upregulated in prostate cancer tissueas compared with that in its para-carcinoma tissue. Conclusion Phosphorylation of EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, Insulin R, Axl, PDGFRα, PDGFRβ, M-CSFR, VEGFR2 in prostate cancer tissue may contribute to development and progress of prostate cancer.

prostatic neoplasms; receptor tyrosine kinase

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.06.007

R 737.25

△共同第一作者

*共同通訊作者, 周文龍, E-mail: zhouwenlong6063@sina.com; 俞強, E-mail: qyu@sibs.ac.cn