乳鐵蛋白與牛乳中其他蛋白質相互作用機制研究進展

周英爽，樊鳳嬌，劉 猛，楊 戩，王 韞，杜 明*，張蘭威

（哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

乳鐵蛋白與牛乳中其他蛋白質相互作用機制研究進展

周英爽，樊鳳嬌，劉 猛，楊 戩，王 韞，杜 明*，張蘭威

（哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

牛乳蛋白分為酪蛋白和乳清蛋白，其中乳鐵蛋白是乳清蛋白中的一種，具有多種生物學功能，被廣泛應用于食品、醫藥、化妝品工業等領域。在牛乳中，乳鐵蛋白帶正電荷，會與一些帶負電荷的蛋白質，如酪蛋白、骨橋蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白等發生相互作用。這種相互作用影響著這些蛋白的生物化學功能或者分離制備特性，尤其是后者更是工業化生產中需要關注的問題。本文闡述了乳鐵蛋白與牛乳中其他蛋白質之間的相互作用機制及其應用現狀，對于開發乳鐵蛋白的工業化制備方法、以及系統理解牛乳中各種活性蛋白間的協同生物作用等方面都具有重要意義，為乳鐵蛋白生物學特性的深入研究和工業化生產技術開發提供一定依據。

乳鐵蛋白；生物學功能；相互作用；機制；應用

乳蛋白主要分為兩大類：酪蛋白（casein，CN）和乳清蛋白，乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是乳清蛋白中的一種，在乳中含量約為0.02～0.35 g/L。隨著生物工程技術的不斷發展，乳鐵蛋白因其具有多種生物學性質，被廣泛應用于食品、醫藥等領域[1-2]。在牛乳體系中，乳鐵蛋白是以兩種形式存在，一種是自由乳鐵蛋白，另一種是與其他蛋白質結合，形成復合物，即以固定乳鐵蛋白形式存在。闡明乳鐵蛋白與其他蛋白質形成復合物的結合機制，將固定乳鐵蛋白釋放并提取出來，對于開發高效提取乳鐵蛋白技術具有重要意義。本文介紹了乳鐵蛋白與酪蛋白、免疫球蛋白G、骨橋蛋白、β-乳球蛋白之間的相互作用，以期為乳鐵蛋白的低成本、高效率工業化提取新技術奠定一定的理論基礎。

1　牛乳蛋白的主要成分

牛乳蛋白中酪蛋白含量約為80%，乳清蛋白含量約為20%。酪蛋白膠體（casein micelles，CM）主要由四部分組成：αs1-、αs2-、β-、κ-CN，質量之比約為4∶1∶4∶1，平均等電點在4.8[3-4]。乳清蛋白包含α-乳清蛋白（α-lactalbumine）、β-乳球蛋白（β-lactoglobuline）、乳血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶（lactoperoxydase）、免疫球蛋白（immunoglobuline，Ig）等[5]。各種主要蛋白組分的基本特性見表1。

表1　牛乳蛋白主要組成成分Table1Main composition of bovine milk proteinotein

2　乳鐵蛋白與其他牛乳蛋白相互作用及應用

乳鐵蛋白等電點為8.5～9.2，是一種堿性蛋白，在牛乳體系中帶正電荷[6]，會與一些在牛乳中帶負電荷的蛋白發生可逆性結合，如酪蛋白、骨橋蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白等，通過靜電力作用相互結合形成大的復合物存在于牛乳中。

2.1乳鐵蛋白的分子結構

LF分子質量約為80 kD，由一條含689 個氨基酸的多肽鏈組成。不同種屬來源的LF氨基酸序列不同，但其同源性約達70%。不同來源的LF氨基酸序列都含有一個雙重內部重復序列，如N末端序列與C末端序列有40%的一致性。此外，這些LF都能緊密可逆地結合兩個Fe3+和兩個LF的二級結構主要由α-螺旋和β-折疊組成，中間由一段螺旋肽鏈連接，呈“二枚銀杏葉型”結構。

LF的三級結構如圖1A[8]所示，LF蛋白分子折疊成兩個葉片，即N葉和C葉，這兩個葉片代表著LF多肽鏈的N末端和C末端。每一個葉片又分為兩個結構域，即N-1、N-2、C-1、C-2，而每一個葉片的兩個區域中間的球形是鐵離子的結合位點[8-9]。氨基酸組成了4 個結構域，N-1由1～90和251～333序列組成；N-2由91～250序列組成；C-1由345～431和593～676序列組成；C-2由432～592序列組成。LF的N葉和C葉由3 個翻轉的螺旋連接，氨基酸殘基為334～344[8-9]。與圖1A方向一致的LF電荷分布情況如圖1B[10]所示。在圖的左上角主要分布著中性和負電荷，左下角主要分布著正電荷，右上角主要是中性電荷，右下角主要是中性及負電荷，少量的正電荷。這說明LF強陽離子特性N端在其左下角[10]。由圖1B可知，LF分子的N-1結構域是極強的正電荷富集區，這可能成為LF與其他分子進行相互作用的重要結構和特性基礎。

圖1　LF的三維結構和電荷分布圖Fig.1Three-dimensional structure and charge distribution of lactoferrin

2.2乳鐵蛋白和酪蛋白膠體間的相互作用

2.2.1酪蛋白膠體結構

在牛乳中，酪蛋白的4 種單體組成成分：αs1-、αs2-、β-、κ-CN會進行自我組裝成雙嵌段復合物[11]，通過在水相中疏水作用和靜電排斥作用的平衡形成酪蛋白膠束[12-13]。關于酪蛋白膠體模型有多種猜測，主要包括“套核”結構模型、內部結構模型、亞單元模型和微簇結構模型。其中在LF與CM的相互作用機制研究中，使用較多的“套核”結構模型和亞單元模型。

2.2.1.1“套核”結構模型（coat core models）

“套核”結構模型如圖2所示，αs-CN分子和β-CN分子構成了膠粒的核，表面分布著κ-酪蛋白，磷酸鈣在內外部都存在[14]。2.2.1.2亞單元模型（subunit models）

圖2Payens的“套核”結構模型Fig.2Coat core model of casein micelles structure by Payens

Morr[15]最早提出了亞單元模型，Slattery等[16]提出了由不同組成亞單元構成膠體粒子的模型。Schmidt[17]在以上研究的基礎上提出次級膠體分子模型（圖3）。就目前研究而言，Slattery和Schmidt等提出的模型是最被認可的酪蛋白膠體的結構模型。研究表明：酪蛋白膠體形成的原因是磷酸鈣相和亞單元之間的疏水相互作用，κ-CN位于酪蛋白膠粒的表面，對于酪蛋白膠體的穩定性有很大作用[18]，而αs1-、αs2-、β-CN均勻分布于整個酪蛋白膠粒。

圖3Schmidt的“亞單元”結構模型［17］17Fig.3Subunit model of casein micelles structure by Schmidt［17］

2.2.2乳鐵蛋白與酪蛋白膠體間的動態包裹與釋放機制

研究發現，在pH 4.7條件下，LF結合在酪蛋白膠體上而沉淀[19]。根據Croguennec等[20]研究發現，LF在牛乳自然條件下（pH 6.8），帶有正電荷，而酪蛋白膠體（pI 4.6）帶負電荷，兩者會通過靜電作用相互結合[21]。根據上述研究結果，乳鐵蛋白與酪蛋白膠束在牛乳體系中的相互作用機制如圖4所示。

圖4乳鐵蛋白與酪蛋白可逆結合機制Fig.4Reversible combination between lactoferrin and caseins

Anema等[22]通過滴定法，向酪蛋白溶液中滴加乳鐵蛋白溶液以及反向滴定的方式，同時測定體系的光散射強度、表面電荷數量以及pH值變化情況，發現酪蛋白的幾種類型α-CN（ACN）、β-CN（BCN）和κ-CN（KCN）以不同的比例與乳鐵蛋白結合。隨著滴定的進行，體系顆粒表面粒徑逐漸變大。通過表面電荷和pH值的變化，Anama推測出LF與ACN、BCN和KCN相互作用的分子比例分別為2∶1、1∶1和1∶4，乳鐵蛋白與不同類型酪蛋白相互作用模型，如圖5所示。

圖5乳鐵蛋白與α--CNN（AA）、β-CNN（BB）、k-CCNN（CC）相互作用模型Fig.5Interaction between LF and either ACN（A），BCN（B）or KCN（C）

2.2.3乳鐵蛋白與酪蛋白膠體復合物（LF-CM）在工業生產中的應用

近年來，已有學者研究從酪蛋白中釋放乳鐵蛋白。Anema等[22-23]研究了從奶酪加工凝塊中釋放LF，發現酸化或者鹽處理能增加LF的釋放量，同時發現，牛乳中添加的LF能夠自發地和酪蛋白膠體相互作用。當大量的LF（20 g/L）添加到牛乳中時，會使LF結合到酪蛋白膠體中的酪蛋白上，伴隨著酪蛋白膠體的膨脹，然后慢慢地有部分分解現象出現[16]。乳鐵蛋白與酪蛋白在牛乳中通過靜電力形成膠體復合物，這一可逆反應在工業生產中有很重要的應用。目前LF的提取技術存在生產流量低，成本高等缺點，又因LF與CM形成LF-CM膠體復合物。研究發現通過改變溫度、離子強度、pH值[24]等物理化學條件，能有效地促進二者之間的解離，同時通過適宜規格的濾膜進行有效的分離LF和LF-CM復合物，進而應用于LF的工業提取生產中，更高效、高產地生產LF。但是目前研究溫度、pH值、離子強度、離子種類對二者結合的影響還不是很全面，研究多采用相對比較純的樣品進行滴定反應[20-21]，對于牛奶中乳糖、脂肪等成分的影響還沒有闡述，這為我們未來的研究提供了方向。

2.3乳鐵蛋白和骨橋蛋白的相互作用及其應用

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種分泌型的磷酸化糖蛋白（secreted phosphoprotein，SPP）。其分子質量為36 kD，等電點pH 3.6左右，在牛乳體系中帶負電荷，是一種酸性蛋白，可與帶正電荷的堿性蛋白發生反應[25]。通過等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC），將LF溶液與OPN溶液相互滴定，發現在牛乳體系中，因LF與OPN帶有相反的電荷，二者通過靜電相互結合形成LF-OPN復合物。研究中發現，當向OPN溶液中滴定LF時，LF優先結合在OPN結合位點A處，隨著LF的增加，會再結合在B、C兩處。雖然A點吸熱量比B、C處少，但是其親和力要比B、C強，如圖6A所示[25]。相反的，當向LF溶液中滴定OPN溶液時，發現LF很自然地結合在OPN的A、B、C三點處。但是隨著OPN的繼續添加，LF從B、C兩處解離，結合在A處，如圖6B[25]所示。在溶液中，LF與OPN以分子比例3∶1結合，形成大的LF-OPN膠體復合物[25]。通過差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry ，DSC）可以觀察到，LF與OPN結合后，總體上其熱熔溫度（Tm）都會變大。綜上研究表明，LF與OPN的結合會改變其熱熔溫度，此外，不同滴定順序結合圖都表明LF與OPN存在相互作用，且在OPN上有3 個LF結合位點。

圖6乳鐵蛋白與骨橋蛋白等溫滴定量熱實驗模型Fig.6Schematic model depicting the interaction between apo-OPN and apo-LF du ring ITC titration experiments

研究發現LF可以通過促進成骨細胞和抑制破骨細胞調節骨再生，LF和OPN能夠在促進成骨細胞增殖中起到協同作用［26］。在LF結構中的N端由K18、R20、R21、R25、K27、K28、R39、R38和周圍殘基組成的區域是OPN結合位點，而這一區域正是LF水解成生物活性乳鐵素肽的部分。OPN能夠有效地保護LF在吸收過程中不被水解，通過潛在地調節乳鐵素肽的釋放，繼而調節其生物活性［27］。LF與OPN的相互作用機制的深入研究，可否為乳鐵蛋白成骨作用機制的闡明，以及新型乳鐵蛋白和骨橋蛋白的新型制備方法的開發提供新的思路，是值得廣大研究人員思考的問題。

2.4乳鐵蛋白和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）的相互作用及其應用

β-Lg是牛乳中一種重要乳清蛋白，分子質量為18～20 kD，其等電點pI值為4.5～5.5，在牛乳體系中，β-Lg帶有負電荷。通常情況下，β-Lg會形成非共價二聚體，存在于牛乳中[28]。研究發現，通過向穩定的β-Lg體系中添加LF，通過納米粒度掃描儀和Zeta電位儀可以測定出β-Lg體系電勢負電位逐漸降低，二者達到結合飽和時，電勢為零，繼續添加LF，電勢為正。向穩定的LF體系中添加β-Lg，同樣得到電勢由正變為負的結果[29]。進而表明，在牛乳體系中，LF與β-Lg因帶有相反電荷而發生靜電結合，形成β-乳球蛋白-乳鐵蛋白（β-lactoglobulin-lactoferrin，BLG-LF）復合物。通常在牛乳中存在兩種形式的BLG-LF復合物，即LF（BLG2）、LF（BLG2）2。在牛乳中，β-Lg形成二聚體（BLG2）2后與LF相互結合，所以復合物主要是以LF（BLG2）2形式存在，復合物模型如圖7[30]所示。通過熱力計量學研究，可以計算出LF與β-Lg結合分子比例為2∶1[30-31]。LF與β-Lg相互吸附在表面，可以使LF吸附在黏膜表層，進而保護黏膜不受病原的侵害。

圖7乳鐵蛋白與乳球蛋白相互作用模型Fig.7Interaction between LF and BLG in bovine milk

在牛乳體系中LF與β-Lg因所帶電荷相反，會發生靜電力結合形成LF-β-Lg復合物。研究LF與β-Lg異種蛋白的可逆性相互作用研究發現，只有在有限的pH值、離子強度、總蛋白質濃度、LF與β-Lg化學計量比條件下，才會形成復合物[30]。LF與β-Lg均具有多種生物學功能。所以，通過研究二者的結合機制，改變體系環境條件，進而有效地促進或者抑制BLG-LF復合物的形成，從而為LF與β-Lg功能性作用發揮提供幫助。可以應用這種可逆性結合機制，進行分離LF和β-Lg，從而提高LF提取率。對于LF和β-Lg復合物的功能還沒有相關報道，所以未來可以從二者復合物功能性展開研究。

2.5乳鐵蛋白和血清白蛋白間的相互作用及其應用

牛血清白蛋白是乳清蛋白中的一種，等電點pI值為4.7左右，在牛乳體系中帶有負電荷。Lampreave等[32]研究發現，BSA與LF因帶有相反的電荷而結合成聚合物存在于牛乳中。通過凝膠色譜法分離干奶期牛奶中鐵飽和乳鐵蛋白，乳鐵蛋白有兩個洗脫峰，其中一個分子質量約為200 kD，另一個分子質量約為150 kD。然而，純化的鐵飽和LF的洗脫峰只有一個，且其分子質量約為67 kD。在200 kD峰和150 kD峰組分中檢測到β-乳球蛋白，在150 kD峰里面檢測到乳白蛋白的存在，而α-乳白蛋白不存在任何峰里。而純化的β-乳球蛋白和乳白蛋白的洗脫峰都在這兩個蛋白峰之后。分子質量以及蛋白檢測結果，都表明LF與乳白蛋白相互作用，且其相互作用物質的量比約為1∶1。

LF-BSA復合物的穩定性會因體系物理化學條件的變化而變化。LF具有多種生物學功能，同樣BSA對酶類活性有保護作用，一般用作穩定劑。通過LF與BSA形成復合物的結合機制闡明，可以通過改變體系條件有效地促進或者抑制二者的結合，進而應用在LF的提取，發揮LF與BSA功能作用中。同時也為LF與BSA在生化研究、遺傳工程和醫藥研究等方面提供幫助。

2.6乳鐵蛋白和免疫球蛋白G（IgG）間的相互作用及其應用

免疫球蛋白（Ig）是牛乳清蛋白中的一種，其等電點pI值為5.5～8.3。Ig分為3 種類型，即IgG、IgM、IgA。其中IgG分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 4 個亞類。Watanabe等[33]在研究在人乳中LF可以與IgA發生靜電力結合。在牛乳體系中，Butler[34]通過凝DEAE膠色譜方法發現了LF-IgG2復合物，繼而闡明在牛乳中，LF與IgG2因帶有相反電荷而發生靜電結合。LF-IgG2復合物的形成是可逆性的。通過改變體系環境條件，能夠改變LF-IgG2復合物的穩定性。LF與IgG均具有多種生物學功能，LF具有抗菌、調節免疫力、抗微生物等功能[35]，免疫球蛋白具有抑菌、免疫和生理調節作用，能夠完整地進入近端小腸，起到保護小腸黏膜的功能[36]，而這一復合物形成機制的研究，可以通過改變體系因素有效地促進或者抑制二者的結合，進而二者有效地發揮各自的功能作用。同時也可以為LF分離提取提供理論基礎。對于LF-IgG2復合物的功能特性和熱力學特性還需要進一步研究，進而應用在醫學、食品等領域。

3　牛乳蛋白質間相互作用的應用展望

隨著對乳清蛋白研究的不斷深入，其應用越來越廣泛。每年由于制作干酪而產生的乳清在全世界高達11 000萬 t，但是不足50%的乳清得到進一步的加工[37]。乳清蛋白包括乳鐵蛋白、免疫球蛋白、β-乳球蛋白及血清白蛋白等，并且每種蛋白都具有其獨特的生物學功能。LF在牛乳中含量低，但因其具有多種生物功能被廣泛研究[38-39]。目前LF的提取技術還存在生產成本高、提取率低等缺點，工業化生產成本較高，造成LF市場價格居高不下。闡明牛乳體系中LF與其他蛋白質的相互作用機制，研究影響兩種蛋白質分子相互作用的因素，如溫度、pH值、離子強度等條件，可逆地促進和抑制LF與其他蛋白質相互作用，我們就可以有針對性地控制這些分子間的相互作用，進而向著所需要的方向進行反應，應用膜技術工業化提取LF，進而開發新型的乳鐵蛋白的工業化制備方法，降低生產成本，從而為在乳制品尤其是嬰幼兒配方乳粉中的應用奠定理論基礎。這對于改變我國乳鐵蛋白長期依賴進口的局面，提高我國乳品工業的國際競爭力具有重要意義。與此同時，闡明這些生物活性蛋白之間的相互作用機制，可以深入理解這些活性蛋白發揮生物學功能的活性機制、它們之間的協同（或抑制）作用，這也是值得我們乳品科學與技術研究者們關注的重要問題。

綜上所述，闡明和理解乳鐵蛋白與牛乳中其他蛋白質的相互作用無論是從科學研究的角度，還是從工業化生產的角度均具有重要意義，值得我們在未來的研究工作中給予重視。

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Interaction Mechanism between Lactoferrin and Other Proteins in Bovine Milk

ZHOU Yingshuang，FAN Fengjiao，LIU Meng，YANG Jian，WANG Yun，DU Ming*，ZHANG Lanwei
（School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin150090，China）

The bovine milk proteins include casein and whey protein. Lactoferrin (LF) is a whey protein that has a variety of biological functions. Lactoferrin is widely used in food additive, medical and cosmetic industries. In bovine milk, lactoferrin is positive to interact with some negatively charged proteins, such as casein and osteopontin, β-lactoglobulin, immunoglobulin and bovine serum albumin. These interactions can affect the biological functions and purification characteristics of these proteins; especially the latter has attracted more and more attentions. In the present review, the mechanism of interactions between lactoferrin and other bovine proteins are clarifi ed, which is important for developing industrial preparation procedures of LF and understanding the synergistic biological activities of these proteins. This review will provide some theoretical references for the development of industrial extraction methods of lactoferrin.

lactoferrin; biological function; interaction; mechanism; application

TS252.1

A

1002-6630（2015）05-0244-06

10.7506/spkx1002-6630-201505045

2014-05-04

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B06-03）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31101316）；國家自然科學基金面上項目（31371805）；教育部“新世紀優秀人才支持計劃”項目（NCET-11-0796）；黑龍江省博士后研究人員落戶黑龍江科研啟動資金項目；中央高校基本科研業務費專項資金項目（HIT.BRETⅢ.201231）

周英爽（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：zyshuang8910@163.com

杜明（1977—），男，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：duming121@163.com