魚類抗凍蛋白結構與抗凍活性的關系

紀瑞慶，劉愛國，*，陳　龍，吳子健，胡兆博，劉　斌

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134；2.天津市食品研究所，天津301609；3.天津商業大學天津市制冷技術重點實驗室，天津300134）

魚類抗凍蛋白結構與抗凍活性的關系

紀瑞慶1，劉愛國1，*，陳龍1，吳子健1，胡兆博2，劉斌3

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134；2.天津市食品研究所，天津301609；3.天津商業大學天津市制冷技術重點實驗室，天津300134）

抗凍蛋白通過不可逆附著于冰特定表面來有效抑制冰晶生長和重結晶，具有很強的抗凍活性。本文選取若干代表性魚類抗凍蛋白為例，闡述6類魚類抗凍蛋白的結構特性（氨基酸殘基組成與特定序列、二級結構組成以及蛋白的空間構象等）、穩定蛋白結構的重要因素以及分子中參與冰晶結合的氨基酸殘基位點，重點揭示蛋白結構與抗凍活性的內在關系，以期為將來的廣泛應用提供一定理論基礎。

魚類抗凍蛋白；結構；抗凍活性；吸附冰晶性能

AFP應用于冰淇淋生產中，消除產品的冰渣感覺，改善品質與口感，并得到了美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）的認可。2006年我國曾公布抗凍蛋白可以作為新的食品添加劑添加到冷凍食品中，由于未出現此類產品在食品工業中的大規模應用，在2012年未被列入食品添加劑列表中。迄今為止，按生物體來源的不同，已發現的AFP可分為魚類抗凍蛋白、昆蟲抗凍蛋白、植物抗凍蛋白、細菌抗凍蛋白。其中對于魚類AFP（特別是源于極地魚類機體的AFP）的研究比較透徹，魚類AFP按照結構可分為6類（圖1）［5］：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、抗凍糖蛋白（antifreeze glycoprotein，AFGP）、高活性抗凍蛋白。

圖1　6種魚類抗凍蛋白的結構示意圖［5］5Fig.1Structural illustration for six kinds of fish antifreeze pro teins［5］

AFP的結構與其抗凍活性具有十分密切的關系。通常在凍結溫度下溶液中的水會形成冰晶結構，但當AFP存在時，情況就會發生變化：一方面，AFP會不可逆地附著到冰晶特定的表面并成為冰晶的一部分，可阻止其他水分子在冰晶表面的吸附，也可掩蔽那些能成為異質冰核的存在位點；另一方面，AFP在冰晶表面的附著會致使吸附蛋白間的冰按照彎曲鋒面生長，此處表面張力加大改變了原有水分子結晶形成冰所需的能量平衡狀態，使得冰在此進一步生長延伸所需能量無法滿足，這就是開爾文效應（Kelvin effect）。在此過程中，溶液的冰點降低，而熔點幾乎保持不變，熔點與降低之后的冰點之間產生的差值即為熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）［6］。以上就是AFP具有抑制冰晶生長及重結晶活性（ice growth and recrystallization inhibition activity）［7］的原因，而THA也被用作衡量抗凍蛋白抗凍活性的一項重要指標。AFP不可逆地附著到冰晶的表面是AFP具有抗凍活性的關鍵，而AFP在冰晶表面的有效附著是AFP與冰晶表面相互作用的結果，在此過程中，AFP的結構，特別是特定區域的結構以及與冰面結合的氨基酸殘基位點起到了十分重要的作用。當然目前不同來源的抗凍蛋白結構多樣，它們的氨基酸殘基序列以及與冰晶結合的相關結構域所形成的構象沒有一致性，且有些AFP蛋白在低溫下還會發生構象改變［8］，造成了目前用構象來判斷蛋白質是否屬于AFP具有一定困難和不確定性，但對AFP晶體結構的進一步探索以及與冰晶體結合位點的確定可以幫助研究人員深入理解AFP與冰晶結合的機制。本文擬通過總結目前已經報道的6種魚類AFP的結構及其與冰晶結合的機制，揭示魚類AFP的結構與抗凍活性的關系，期望能從蛋白質自身結構的角度分析討論魚類AFP具有抗凍活性的內在原因。

1　Ⅰ型抗凍蛋白的結構與抗凍活性的關系

Ⅰ型抗凍蛋白（typeⅠAFP）是一類結構最簡單的魚類AFP，通常含有約40個氨基酸殘基，且富含丙氨酸殘基（約＞60%，如圖2所示）［9］，分子質量約為3.3～4.5ku，其空間結構（圖1b）具有高度或完全α-螺旋化，THA約為0.7℃。該類蛋白發現于美洲擬鰈魚（winter flounder，拉丁名Pseudopleuronectes americanus）、短角杜父魚（shorthorn sculpin，拉丁名Myoxocephalus corpius）［10］的血清和皮膚等組織中，在機體中含量極低，通常為10～15mg/mL。該類蛋白吸附在六棱雙金字塔形冰晶（hexagonal ice）沿<011-2>方向的｛202-1｝錐面上。

圖2Ⅰ型抗凍蛋白的一級結構的氨基酸序列［11］11Fig.2Amino acid sequence f or the primary structure of type I AFP［11］

美洲擬鰈血清中發現的HPLC-6就是一種典型的Ⅰ型抗凍蛋白，分子質量3.3ku，由37個氨基酸殘基組成（圖2a），且包含3個由11個氨基酸殘基組成的重復序列單元（Thr-Al a-Ala-X-Ala-X-X-Ala-Ala-X-X，其中X為任意氨基酸殘基），含23個丙氨酸殘基（62%）且多成簇排列，此氨基酸易形成α-螺旋結構，疏水性氨基酸殘基（如丙氨酸殘基、亮氨酸殘基）約占67.6%，親水性氨基酸約占32.4%。HPLC-6空間結構幾乎完全由雙親右手α-螺旋構成，只有C端的最后一個螺圈為310螺旋。HPLC-6上N端和C端各自含有一個帽子結構，維系著整個分子螺旋結構的穩定性（圖3a），其中N端帽子結構上的Asp1、Thr2、Ser4以及Asp5殘基側鏈和兩個緊密結合的水分子間的8個氫鍵構成一個有序的氫鍵網絡；而C端帽子結構由Arg37殘基側鏈和酰胺化羧基端形成的3個氫鍵組成［11-12］。HPLC-6分子沿著螺旋軸向方向形成3個面（圖3b）：1）疏水面，由丙氨酸和蘇氨酸殘基的甲基組成；2）親水面，由精氨酸殘基、谷氨酸殘基、絲氨酸殘基和天冬酰胺殘基組成；3）Thr-Asx面，主要由蘇氨酸殘基和天冬酰胺/天冬氨酸殘基的親水性基團組成［13］。這種結構使得分子上的4個蘇氨酸殘基（Thr2、Thr13、Thr24和Thr35）等間距排列于疏水面和Thr-Asx面之間的棱邊上（圖3c）［14］。

圖3HPLC-6蛋白的構象示意圖［13］13Fig.3Schematic diagram of HPLC-6［13］

HPLC-6的構象可以清晰地表明Ⅰ型AFP分子中連續完整螺旋化結構與該類抗凍蛋白的抗凍活性有密切關系。首先，Ⅰ型AFP螺旋構象的長度是決定其抗凍活性強弱的重要因素，長度越長則THA越高，抗凍活性越強，HPLC-6含有3個由11個氨基酸殘基組成的重復序列單元，形成了約10個α-螺旋圈和1個310螺旋圈，在質量濃度為10mg/mL時，其THA為0.68℃，而同樣來源于美洲擬鰈魚的AFP9亞型蛋白則含有4個由11個氨基酸殘基組成的重復序列單元（圖2b），因此其所含螺旋圈數高于HPLC-6，在質量濃度為10mg/mL時，AFP9亞型蛋白的THA為1.0℃［16］。這種特點的潛在原因在于AFP是通過吸附冰晶來抑制冰晶的生長，而Ⅰ型AFP的螺旋構象正是其與冰晶表面相結合匹配重要因素，提高螺旋結構的長度或者說增加重復序列的數目（即增加了螺旋圈數）也就增加了Ⅰ型AFP與冰晶相作用的面積。其次，HPLC-6吸附于冰晶的椎體平面（pyramidal plane）［17］，而Ⅰ型AFP中沿著螺旋軸向方向形成3個面中至少有一個面是與冰晶結合的結合面。最初Ⅰ型AFP-冰晶結合理論認為Thr—Asx面是蛋白與冰晶結合的結合面，而分子中Thr殘基與水分子所形成的氫鍵是結合的主要驅動力。但是近年來越來越多的研究結果指出由Ala和Thr殘基上的甲基所形成的疏水面才是蛋白與冰晶吸附的結合面，該面上的氨基酸殘基（Thr、i+4Ala、i+8Ala）為冰晶結合位點，主要的證據來自于：Zhang Wei等［18］利用突變體實驗證明HPLC6上蘇氨酸殘基的甲基對其與冰晶結合能力至關重要；Baardsnes等[19]通過的突變體實驗表明Ala17和Ala21位于HPLC-6與冰晶結合區域；Mao Yougang等[20]證實Ala殘基上的甲基作用于冰水界面的冰晶表面，并且推斷Ⅰ型抗凍蛋白皆含有一個富丙氨酸殘基的α-螺旋結構，且這些丙氨酸殘基又進一步形成一個疏水性的冰晶結合平面，而α-螺旋親水面上的極性氨基酸殘基可提高AFP的溶解性。另外，Thr-Asx面上的Leu殘基可防止AFP在生理質量濃度（10mg/mL）下聚集，Asn殘基可提高HPLC-6的溶解性[21]；Lys18與Glu22間的鹽橋雖不會影響抗凍活性，但可穩定蛋白的構象，并且鹽橋數量的增加也可增加蛋白的溶解性[22]。

2　Ⅱ型抗凍蛋白結構與抗凍活性的關系

Ⅱ型抗凍蛋白（typeⅡAFP）是一類富含半胱氨酸殘基的魚源抗凍蛋白，發現于鯡魚、胡瓜魚等的血清中，分子質量范圍為11～24ku，THA約為0.13℃。根據其吸附冰晶是否依賴Ca2+的參與，Ⅱ型AFP又可分為兩種亞型：Ca2+依賴亞型與Ca2+不依賴亞型。但這兩種亞型的Ⅱ型AFP構象極其相似，其中Ca2+有助于蛋白質分子構象的穩定[23]。該類蛋白通過吸附冰晶的｛101-0｝棱面從而顯示出其抗凍活性。

圖44源于Clupea harenngguuss的AFP的一級結構的氨基酸序列［2233］Fig.4Amino acid sequence for the primary structure of AFP from Clupea harengus［23］

大西洋鯡魚抗凍蛋白（herring antifreeze protein，拉丁名Clupea harengus，hAFP）是一種由130個氨基酸殘基（Ala1～Lys130），如圖4所示，構成的Ⅱ型Ca2+依賴亞型的抗凍蛋白中疏水性氨基酸約占36.9%，親水性氨基酸約占63.1%；所含的10個半胱氨酸殘基形成5對二硫鍵（Cys4～Cys15，Cys32～Cys125、Cys69～Cys100、Cys89～Cys111、Cys101～Cys117）；整個分子構象類似于Rossman折疊結構域（Rossman fold domain），如圖5a所示，8條β-折疊股（β1，aa9～11；β2，aa14～23；β3，aa38～39；β4，aa62～67；β5，aa76～77；β6，aa101～106；β7，aa111～115；β8，aa121～128）構成扭曲居中的反向平行β-折疊，兩側各排列一個α-螺旋（α1，aa25～33；α2，aa45～53）；分子中參與Ca2+結合的區域位于Gln92～Asp114之間的無規則卷曲，即：“Ca2+結合環”（Ca2+-binding loop），其中的Gln92Oε1、Asp94Oδ2、Glu99Oε1、Asn113Oδ1、Asp114O和Oδ1與Ca2+形成配位鍵（圖5b）。

圖5hAFP的構象示意圖［24］24Fig.5Schematic representation of AFP structure［24］

hAFP吸附冰晶并抑制冰晶生長的因素在于：首先，Thr96、Thr98、Asp94和Glu99是hAFP與冰晶進行有效吸附的結合位點［24］，天然狀態下，這些氨基酸殘基共同形成一個較平坦的平面，并受到“Ca2+結合環”兩側二硫鍵（Cys69～Cys100與Cys89～Cys111）的穩定作用，該平面能與冰晶晶格表面有效吸附，并抑制冰晶的生長［25］；另一個方面，“Ca2+結合環”上配位結合的Ca2+不僅穩定了hAFP蛋白構象，更協同加強了hAFP與冰晶的相互作用，當蛋白與冰晶作用時，與Ca2+配位相連的有序水分子也可成為生長冰晶的一部分。

薩哈林小眼八角魚抗凍蛋白（longsnout poacher antifreeze protein，拉丁名Brachyopsis rostratus，LpAFP）是由127個氨基酸殘基構成的單亞基蛋白，屬于典型的Ⅱ型Ca2+不依賴亞型的抗凍蛋白，疏水性氨基酸殘基約占42.8%，親水性氨基酸殘基約占57.2%；所含的10個半胱氨酸殘基構成了5對二硫鍵（Cys4～Cys15、Cys32～Cys122、Cys66～Cys97、Cys86～Cys108、Cys98～Cys114），其一級結構如圖6所示。LpAFP的分子構象與hAFP相似［26］，類似于Rossman折疊模式（Rossman fold）（圖7）。整個分子的二級結構包括2個α-螺旋（α1，aa25～34；α2，aa45～54）、8個β-折疊股（β1，aa9～11；β2，aa14～22；β3，aa38～39；β4，aa59～64；β5，aa73～74；β6，aa98～102；β7，aa109～112；β8，aa118～125）以及4個環區（L1，aa66～72；L2，aa74～78；L3，aa86～89；L4， aa91～97），其中L3、L4以及β7、β6的C端、β4的N端及其周圍氨基酸殘基組成較平坦的平面，此平面又被分為兩部分：疏水區（連接二級結構的無規則片段：Gly57～Ile58、Ala103～Ala104、Pro113～His118）和親水區（環區和β-折疊股）。以Ile58為中心的疏水區是吸附冰晶的位點，此區與冰晶晶格匹配而緊密結合。Ile58周圍發現含有有序的碳原子（Ile58的Cδ、Ala103的Cβ、His118的Cε），這與Doxey等［27］報道AFP的冰結合區域中有序的表面碳原子靠近極性原子一致。Asn91、Asp110、Asp111（對應于結合Ca2+的氨基酸殘基）與一個水分子形成氫鍵，與二硫鍵Cys66～Cys97、Cys86～Cys108一起維持環區的構象穩定。

圖66源于Brachyopsis rostraattuuss的AFP的一級結構的氨基酸序列［2233］Fig.6Amino acid sequence for the primary structure of AFP from Brachyopsis rostratus［23］

圖7lpAFP的整體折疊構象［26］26Fig.7Overall folding of longsnout poacher lpAFP［26］

3　3Ⅲ型抗凍蛋白結構與抗凍活性的關系

Ⅲ型抗凍蛋白（typeⅢAFP）是一類分子質量約為7.0ku（6.5～7.14ku）的球蛋白（圖8a），THA一般為0.53℃。該類蛋白的兩個端瓣（N端瓣和C端瓣）各含有一個由若干不完全的短β-折疊股形成的β-片層，兩個β-片層間夾著一段只有一個螺旋圈的α-螺旋；主鏈內許多“類似β-結構”的β-股間氫鍵使得整個蛋白折疊緊密并具一定剛性（圖1、8）；蛋白構象中含有能與冰晶表面（棱面或錐面）相互作用的平坦面，此面與晶格的棱面上氧原子形成互補的結構，并且還與錐面互補，形成六方雙錐體冰晶。蛋白表面通過氫鍵識別冰晶的結合面，互補性的結構允許冰晶-蛋白之間范德華力相互作用，加強冰晶-蛋白的相互吸引力，使得蛋白更好的吸附冰晶。

美國大綿鳚（eel pout，拉丁名Macrozoarces americanus）含有12種Ⅲ型抗凍蛋白，分別為HPLC-1～HPLC-12，目前研究比較透徹的是HPLC-12。HPLC-12具有典型的Ⅲ型抗凍蛋白的空間構象，也屬于季銨基乙基-葡聚糖凝膠結合型（quaternary aminoethyl（QAE）-sephadex-binding group）Ⅲ型抗凍蛋白，即QAE型[28]。該蛋白含有66個氨基酸殘基，其N端瓣和C端瓣各含有一個β-片層（每個片層各含3股β-折疊股）（圖8a），aa3～7、aa15～17、aa22～26、aa43～45、aa53～54、aa60～62分別形成6段不完整的β-折疊股；37～40aa為短的α-螺旋［29］。不過也有觀點認為33～43aa形成5個β-轉角，而33～37aa和36～40aa間連續的兩兩轉角分別形成兩個310-螺旋［30］。不同溫度條件下，該蛋白的構象基本不變［30］。

目前，對該蛋白與冰晶相互作用并結合的機制解釋有兩種理論：1）單個雙親冰晶結合平面理論［29］，該理論的提出較早，HPLC-12含有一個能與冰晶基本棱面（primary prism plane，PPP）吸附的擬平行四邊形平面（pseudo-parallelogram），其中Thr18和Ala16的羰基以及Gln44相連形成擬平行四邊形的一條邊，而Gln9和Thr15形成了平行的另一條邊，兩邊相距4.5?，并且該面被鄰近的一些疏水性氨基酸殘基（Leu10、Pro12、Ile13、

Leu19、Val20、Val41以及Leu51）圍繞；擬平行四邊形上的Gln9、Thr15和Thr18側鏈上的氧原子、Gln44側鏈上的氮原子以及Ala16的主鏈氧原子共同形成與冰晶表面水分子直接作用的平坦平面（圖8b），且這5個原子間的距離與冰晶棱面水分子上氧原子的間距完全匹配；正是這些關鍵原子和冰晶表面氧原子之間的氫鍵作用使得HPLC-12能沿著六棱形冰晶的中心軸（即C軸）方向與冰晶棱面結合。2）復合冰晶結合平面型理論［31］，該理論目前較為流行，HPLC-12的分子質量雖然只有7.0ku，卻擁有兩個能與冰晶上平行于冰晶C軸或稍微傾斜的表面（即所吸附冰晶的棱面和所吸附冰晶的錐面）同時相互吸附的平面，兩個面相鄰呈150°，且均位于蛋白上較為疏水的區域（圖8c），其中Thr18、Leu19、Val20、Val41組成的平面與PPP吸附，而Gln9、Leu10、Ile13、Asn14、Thr15、Ala16、Met21和Gln44負責其與冰晶錐面的吸附作用。

圖8Ⅲ型AFP的構象和復合冰晶吸附位點示意圖Fig.8Schematic representation of AFP structure

4　Ⅳ型抗凍蛋白結構與抗凍活性的關系

Ⅳ型抗凍蛋白（typeⅣAFP）是一類具有四螺旋捆結構域（由4個反平行左手α-螺旋組成）的抗凍蛋白，如圖1e所示。其分子質量約為Ⅰ型抗凍蛋白的3倍左右，大約為12.0ku，富含谷氨酸殘基（17%），THA較低，一般為0.08～0.5℃。此類蛋白吸附在對稱于垂直C軸的一個軸兩側，呈香腸型的吸附面積，使得冰晶呈扭曲的六方雙錐體（hexagonal bipyramid），即六方偏方面體（hexagonal trapezohedra）。

長角杜父魚（longhorn sculpin，拉丁名Myoxocephalus octodecimspinosis）血清中分離的LS-12是最早發現的Ⅳ型抗凍蛋白，其一級氨基酸殘基序列如圖9所示，分子質量為12.3ku，由108個氨基酸殘基組成，含11個谷氨酸殘基（約10.1%）和17個谷氨酰胺殘基（約15.7%），疏水性氨基酸殘基約占41.6%，親水性氨基酸殘基約58.4%，N端含有一個焦谷氨酰基團；其空間構象高度螺旋化，具有典型的四螺旋捆（four-helix bundle）結構域（圖10），每個螺旋的疏水側鏈居于各螺旋間并形成疏水核心，而親水側鏈則位于旋捆的外表面，可與冰晶表面形成特異性吸附［32］。當LS-12蛋白存在時，形成的冰晶結構呈六方偏方面體，而不是常見的六方雙錐體，冰蝕刻實驗發現它并不吸附六方雙錐體棱面（如美洲擬鰈AFP）和第二棱面（如短角杜父魚AFP），而是吸附在對稱于垂直C軸的一個軸兩側，因此冰晶形態不同于其他抗凍蛋白［33］。

圖99源于Myoxocephalus octodecimspinoossiiss的AFP的一級結構的氨基酸序列［3322］Fig.9Amino acid sequence for the primary structure of AFP from Myoxocephalus octodecimspinosis［32］

圖1　0LS-12的結構示意圖［33］33Fig.10Schematic representation of LS-12structure［33］

通常Ⅳ型抗凍蛋白在宿主機體中的含量極低，如LS-12在宿主機體內的質量濃度僅為100μg/mL，機體并沒有產生足夠數量的AFP保護宿主防凍［34］，對于Ⅳ型抗凍蛋白的功能仍存在爭議，但目前認為它可能含有抗凍活性，并且除了結合冰晶的功能外還可能具有結合配體的功能。此外，發現該類蛋白在宿主胚胎發育的整個期間高度表達，如另一種Ⅳ型抗凍蛋白——銀鯽Ⅳ型抗凍蛋白（Carassius auratus gibelio antifreeze typeⅣprotein，CagAFPⅣ）。Liu Jingxia等［35］的研究表明，CagAFPⅣ蛋白基因的轉錄始于囊胚期，并且在整個宿主的胚胎發育期都保持高水平的表達，而其在已孵化成的幼體內表達急劇下降。表明其可能具有保護尚未產生血液循環系統胚胎的功能，這對魚類進化可能具有益處，使得生物機體在獲得有活性的抗凍蛋白前能夠適應寒冷環境［36］。

5　抗凍糖蛋白結構與抗凍活性的關系

抗凍糖蛋白（antifreeze glycoprotein，AFGP）是一類富含糖基的抗凍蛋白，其THA一般為1.2℃。該類蛋白的一級序列含重復的三肽單元，即Ala—Ala—Thr（圖11），其中蘇氨酸殘基的β-羥基上結合一個O-連接的二糖基團，為β-D-吡喃半乳糖苷-（1，3）-2-乙酰氨基2-脫氧-β-D-

吡喃半乳糖（圖1a）。AFGP所含三肽單元的重復數目范圍為4～50，因此AFGP的分子質量范圍為2.6～33.7ku。根據分子質量的不同，AFGP可分為8種亞型，AFGP1亞型分子質量最大，為33.7 ku，而AFPG8亞型分子質量最小，為2.6 ku。對于AFGP的空間構象的認識目前沒有統一觀點，早先運用圓二色譜和核磁共振的研究表明AFGP

的空間構象為延展狀的無規則卷曲；也有研究表明它們的構象呈有序的雙親螺旋結構，糖基排列在螺旋一側，因此其親水面含有二糖基的羥基，而疏水面包含氨基酸殘基上疏水性的甲基；但是目前多數的研究表明分子質量較大的

AFGP1～AFGP5亞型并不具有長而有序的結構（long-range order structure），而分子質量很小的AFPG8亞型整體是無規則卷曲結構，但也有局部有序片段的存在［5］。

圖1　1AFGP3亞型的一級結構的氨基酸序列［37］37Fig.11Amino acid seq uence for the primary structure of AFGP3［37］

由于通常南極魚（Antarctic notothenioid，拉丁名Notothenia coriiceps）等抗凍魚機體中含多種AFGP，并且制備單種AFGP純品非常困難，目前對AFGP抗凍機制以及它們的結構與抗凍活性關系的研究還不夠深入。另外，迄今為止利用分子生物學技術表達并純化AFGP還未成功，因此目前主要通過化學合成的方法制備一定量的AFGP純品來研究各種AFGP蛋白結構與性質的關系［15］。Tachibana等［38］通過液相合成了幾種AFGP的類似物，發現AFGP能夠具有顯著抗凍活性的主要結構要素為：連接在每一個蘇氨酸殘基上的二糖糖基必須是α-構象，N-乙酰基團必須位于C2位上，二糖糖基必須是半乳糖型，蘇氨酸殘基上的α-甲基對抑制冰晶生長活性非常關鍵。糖基中的若干個羥基（除了C6位）對抗凍活性有很大影響，而主鏈的氨基酸組成對活性無明顯影響［39］。研究發現半乳糖基與多肽主鏈合適的距離才能保持其活性，水合作用和在凍結狀態下主軸構象無明顯改變對冰晶抑制也有重要作用［40-41］。多肽鏈越長活性越大，一定條件下形成二聚體以及α-螺旋含量增加以及高度靈活性的構象都會增加AFGP全部分子與冰晶的作用，允許更強大的吸附，而增強抗凍活性［42-44］。AFGP動力學研究表明其兩步抑制冰晶過程：1）不完整的吸附或改變表面較弱的作用；2）較強的作用實現完整的吸附以抑制冰晶生長。冰晶生長從一個粗糙表面形成一個平整表面，在過冷溫度下停止生長，然而之后的回復生長過程中，蛋白釋放到液相中而不是之前所認為的成為冰晶的一部分，因此認為抗凍行為只是純粹的動力學現象［45］。

6　高活性抗凍蛋白結構與抗凍活性的關系

高活性抗凍蛋白（hyperactive antifreeze protein，HAFP）是最后一類發現于魚類機體中的AFP，分子質量較其他AFP大，該類AFP在較低濃度時就能表現出高效的抗凍活性，其質量濃度在4mg/mL時，THA為2℃。該類蛋白是由相同亞基組成的同源二聚體，空間構象呈四螺旋捆（圖13a）。此類蛋白具有熱不穩定性，在室溫條件下易分解并導致其抗凍活性的降低，因而這些蛋白難以在魚類中檢測出來［46］。

最早在美洲擬鰈（winter flounder，拉丁名Pseudopleuronectes americanus）中發現一種HAFP，被稱為Maxi。Maxi為由兩個分子質量約為17ku的相同亞基組成的同源二聚體，如圖12所示，每個亞基均含195個氨基酸殘基，其中丙氨酸殘基含量為62%，其一級序列含有類似于Ⅰ型抗凍蛋白的由11個氨基酸殘基（Ile/ ThrXXXAlaXXXAlaXX，X為任意氨基酸殘基）組成的重復單元（圖12）。Maxi亞基由一個長約145?的螺旋-環-螺旋模體（helix-loop-helix motif）構成，其二級結構組成中以α-螺旋為主（含量＞95%）［47-48］，中部所含的一個Ω-環區（由每個亞基中間的7個氨基酸殘基構成）將長約290?的亞基180°對折，使得N端和C端彼此相鄰排列于亞基的一頭，且兩端各含有一個帽子結構維持著螺旋構象的穩定性；從二級結構的層面來說，各亞基大部分（除了中部的Ω-環區以及N端和C端的帽子結構）是由11個氨基酸殘基重復單元序列串聯構成的連續螺旋，每個重復單元會形成3圈螺旋（平均每3.7個殘基圍成1圈），較典型的α-螺旋（平均每3.6個殘基圍成1圈）松弛一些。Maxi二聚體的空間構象如圖13a所示，兩個亞基空間相互并不重疊，而是以反向并列方式對齊排布（即兩個亞基的N端瓣螺旋以及兩個亞基的C端瓣螺旋分別反向比鄰排列）進一步形成如棒狀的四螺旋捆結構，整個分子具有一個雙重旋轉對稱軸［49-50］。整個分子的空間構象中，亞基間緊密接觸部位主要位于各亞基的帽子結構區域以及Ω-環區：在二聚體的一頭，一個亞基環區部位的Leu94和Tyr103與另一個亞基N端帽子上的Ile2和C端帽子上的Phe191親密接觸，形成了含有兩個芳香族側鏈堆積的局部性疏水區域（圖13b）；在二聚體的另一頭，一個亞基環區的Lys100側鏈上亞氨基與另一亞基Ala191、Ala192以及Ala194主鏈羰基形成氫鍵，而其自身的Leu94和Ile97主鏈羰基與Asn98側鏈羰基則接受來自另一亞基Arg7的氫鍵；而在二聚體中間部位，來自各亞基N端瓣螺旋的Ile51和Ile54以及C端瓣螺旋的Val144和Val148形成疏水簇。而分子中一系列重復單元所形成的螺旋區域則是依靠弱的范德華力來維系的，其結構間隙明顯疏松（圖13c），且恰好只能容納單層的水分子，這些水分子在蛋白內部的氨基酸殘基（多為丙氨酸殘基、蘇氨酸殘基）周圍形成伸展的五邊形水環網絡（polypentagonal network），如圖13d所示，當然偶而也有一些四邊形、六邊形的水分子環。

圖1　2源于Pseudopleuronectes americaannuuss的MMaaxxii的一級結構的氨基酸序列［4499］Fig.12Amino acid sequence for the primary structure of HAFP from Pseudopleuronectes americanus［49］

整個蛋白分子形成一個半開放的籠型結構（semiclathrate structure）：約400個水分子位于蛋白內部，形成兩個彼此交叉且約呈90°的單分子水層，而另一部分水分子會溢出并延伸到蛋白的表面形成有序的水分子網絡，進而與冰面上的準液體層（quasi-liquid layer）融合并一起凍結（圖13d）。此時，N端瓣螺旋和C端瓣螺旋表面上的結晶水分子簇（圖13a、13d中框內區域）可與冰晶上多個表面匹配。此二聚體與冰晶結合的氨基酸殘基位于分子的內部，而那些與冰面融合并一起凍結的水分子就像是從Maxi分子內部伸出的“錨”，讓Maxi蛋白緊緊地吸附于冰晶表面，是Maxi蛋白折疊迫使水分子溢出機制與半開放籠型結合水錨定機制共同作用的結果。

圖1　3Maxi四螺旋捆結構以及其半開放的籠型結構示意圖［50］50Fig.13Four-helix bundle structure with an open core of HAFP［50］

7　結語

目前對于魚類AFP參與抗凍活性的關鍵因素已經有了很深入的認識，人們已經能夠從分子動力學層面上解析AFP結構與抗凍活性的內在聯系。這些魚類AFP的氨基酸殘基組成、糖基含量、分子質量以及空間構象雖然有一定差異，但都具有一定的抗凍活性，都能有效地與冰晶進行不可逆結合，并進一步防止冰晶的生長，有的AFP具有與冰晶表面結構互補的平面，如：Ⅰ型抗凍蛋白、Ⅱ型抗凍蛋白、Ⅲ型抗凍蛋白；而有的AFP則通過錨定機制與冰晶結合，如HAFP；而穩定AFP-冰晶復合物的主要作用力為疏水相互作用和范德華力。AFP具有廣泛的應用前景，但是對于如何開放和利用AFP，仍然存在以下問題：1）目前抗凍蛋白主要是從極地魚類、陸地昆蟲、植物、細菌等生物體中分離純化得到，而這些生物機體中AFP含量很低，造成提取與分離的困難，產量也很低，因此亟待開發AFP的新來源；2）目前利用生物技術改造微生物，通過重組微生物的方式來表達與產生AFP，所得到的產品在應用時存在食品安全性問題。我們有理由相信，隨著生物技術的進步，以上問題可以逐步得到解決，AFP的應用也會更加廣泛。

［1］DENG Cheng，CHENG C H C，YE Hua，et al.Evolution of an antifreeze protein by neofunctionalization under escape from adaptive conflict［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2010，107（50）：21593-21598.

［2］張暉，張艷杰，王立，等.抗凍蛋白在食品工業中的應用現狀及前景［J］.食品與生物技術學報，2012，31（9）：897-903.

［3］ZACHARIASSEN K E，KRISTIANSEN E.Ice nucleation and antinucleation in nature［J］.Cryobiology，2000，41（4）：257-279.

［4］BINDSLEV-JENSEN C，STEN E，EARL L K，et al.Assessment of the potential allergenicity of ice structuring protein typeⅢHPLC12using the FAO/WHO2001decision tree for novel foods［J］.Food and Chemical Toxicology，2003，41（1）：81-87.

［5］CAPICCIOTTI C J，DOSHI M，BEN R N.Recent developments in the study of recrystallization［M］.Rijeka：In Tech Europe，2013：177-224.

［6］RAYMOND J A，DEVRIES A L.Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1977，74（6）：2589-2593.

［7］GRAETHER S P，SYKES B D.Cold survival in freezeintolerant insects［J］.European Journal of Biochemistry，2004，271（16）：3285-3296.

［8］GRAETHER S P，GAGN S M，SPYRACOPOULOS L，et al.Spruce budworm antifreeze protein：changes in structure and dynamics at low temperature［J］.Journal of Molecular Biology，2003，327（5）：1155-1168.

［9］CHENG A，MERZ K M.Ice-binding mechanism of winter flounder antifreeze proteins［J］.Biophysical Journal，1997，73（6）：2851-2873.

［10］BAARDSNES J，JELOKHANI-NIARAKI M，KONDEJEWSKI L H，et al.Antifreeze protein from shorthorn sculpin：identification of the ice-binding surface［J］.Protein Science，2001，10（12）：2566-2576.

［11］HARDING M M，WARD L G，HAYMET A D J.TypeⅠ‘antifreeze’proteins［J］.European Journal of Biochemistry，1999，264（3）：653-665.

［12］PATEL S N，GRAETHER S P.Structures and ice-binding faces of the alanine-rich typeⅠantifreeze proteins［J］.Biochemistry and Cell Biology，2010，88（2）：223-229.

［13］JOROV A，ZHOROV B S，YANG D S C.Theoretical study of interaction of winter flounder antifreeze protein with ice［J］.Protein Science，2004，13（6）：1524-1537.

［14］EWART K V，LIN Q，HEW C L.Structure，function and evolution of antifreeze proteins［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，1999，55（2）：271-283.

［15］BANG J K，LEE J H，MURUGAN R N，et al.Antifreeze peptides and glycopeptides，and their derivatives：potential uses in biotechnology［J］.Marine Drugs，2013，11（6）：2013-2041.

［16］CHAO H，HODGES R S，KAY C M，et al.A natural variant of typeⅠantifreeze protein with four ice-binding repeats is a particularly potent antifreeze［J］.Protein Science，1996，5（6）：1150-1156.

［17］KNIGHT C A，CHENG C C，DEVRIES A L.Adsorption of alphahelical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes［J］.Biophysical Journal，1991，59（2）：409-418.

［18］ZHANG Wei，LAURSEN R A.Structure-function relationships in a typeⅠantifreeze polypeptide the role of threonine methyl and hydroxyl groups in antifreeze activity［J］.Journal of Biological Chemistry，1998，273（52）：34806-34812.

［19］BAARDSNES J，KONDEJEWSKI L H，HODGES R S，et al.New ice-binding face for typeⅠantifreeze protein［J］.FEBS Letters，1999，463（1）：87-91.

［20］MAO Yougang，BA Yong.Insight into the binding of antifreeze proteins to ice surfaces via13C spin lattice relaxation solid-state NMR［J］.Biophysical Journal，2006，91（3）：1059-1068.

［21］LOEWEN M C，CHAO Heman，HOUSTON M E，et al.Alternative roles for putative ice-binding residues in typeⅠantifreeze protein［J］.Biochemistry，1999，38（15）：4743-4749.

［22］WEN Dingyi，LAURSEN R A.Structure-function relationships in an antifreeze polypeptide.The effect of added bulky groups on activity［J］.Journal of Biological Chemistry，1993，268（22）：16401-16405.

［23］KUNDU S，ROY D.Structural analysis of Ca2+dependent and Ca2+independent typeⅡantifreeze proteins：a comparative molecular dynamics simulation study［J］.Journal of Molecular Graphics and Modelling，2012，38：211-219.

［24］LIU Yang，LI Zhengjun，LIN Qingsong，et al.Structure and evolutionary origin of Ca2+-dependent herring typeⅡantifreeze protein［J］.PLoS One，2007，2（6）：e548.doi：10.1371/journal. pone.0000548.

［25］LI Zhengjun，LIN Qingsong，YANG D S C，et al.The role of Ca2+-coordinating residues of herring antifreeze protein in antifreeze activity［J］.Biochemistry，2004，43（46）：14547-14554.

［26］NISHIMIYA Y，KONDO H，TAKAMICHI M，et al.Crystal structure and mutational analysis of Ca2+-independent typeⅡantifreeze protein from longsnout poacher， Brachyopsis rostratus［J］.Journal of Molecular Biology，2008，382（3）：734-746.

［27］DOXEY A C，YAISH M W，GRIFFITH M，et al.Ordered surface carbons distinguish antifreeze proteins and their ice-binding regions［J］.Nature Biotechnology，2006，24（7）：852-855.

［28］SCHRAG J D，CHENG C H C，PANICO M，et al.Primary and secondary structure of antifreeze peptides from arctic and antartic zoarcid fishes［J］.Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Protein Structure and Molecular Enzymology，1987，915（3）：357-370.

［29］JIA Z，DELUCA C I，CHAO H，et al.Structural basis for the binding of a globular antifreeze protein to ice［J］.Nature，1996，384：285-288.

［30］ANTSON A A，SMITH D J，ROPER D I，et al.Understanding the mechanism of ice binding by typeⅢantifreeze proteins［J］.Journal of Molecular Biology，2001，305（4）：875-889.

［31］GARNHAM C P，NATARAJAN A，MIDDLETON A J，et al.Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging［J］.Biochemistry，2010，49（42）：9063-9071.

［32］DENG Gejing，ANDREWS D W，LAURSEN R A.Amino acid sequence of a new type of antifreeze protein，from the longhorn sculpin Myoxocephalus octodecimspinosis［J］.FEBS Letters，1997，402（1）：17-20.

［33］DENG Gejing，LAURSEN R A.Isolation and characterization of an antifreeze protein from the longhorn sculpin，Myoxocephalus octodecimspinosis［J］.Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Protein Structure and Molecular Enzymology，1998，1388（2）：305-314.

［34］GAUTHIER S Y，SCOTTER A J，LIN F H，et al.A re-evaluation of the role of typeⅣantifreeze protein［J］.Cryobiology，2008，57（3）：292-296.

［35］LIU Jingxia，ZHAI Yanhua，GUI Jianfang.Molecular characterization and expression pattern of AFPⅣduring embryogenesis in gibel carp（Carassiu auratus gibelio）［J］.Molecular Biology Reports，2009，36（7）：2011-2018.

［36］LEE J K，KIM Y J，PARK K S，et al.Molecular and comparative analyses of typeⅣantifreeze proteins（AFPⅣs）from two Antarctic fishes，Pleuragramma antarcticum and Notothenia coriiceps［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molexcular Biology，2011，159（4）：197-205.

［37］DEVRIES A L，VANDENHEEDE J，FEENEY R E.Primary structure of freezing point-depressing glycoproteins［J］.Journal of Biological Chemistry，1971，246（2）：305-308.

［38］TACHIBANA Y，FLETCHER G L，FUJITANI N，et al.Antifreeze glycoproteins：elucidation of the structural motifs that are essential for antifreeze activity［J］.Angewandte Chemie，2004，116（7）：874-880.

［39］HARDING M M, ANDERBERG P I, HAYMET A D J. ‘Antifreeze’glycoproteins from polar fish[J]. European Journal of Biochemistry, 2003, 270（7）：1381-1392.

［40］CZECHURA P，TAM R Y，DIMITRIJEVIC E，et al.The importance of hydration for inhibiting ice recrystallization with C-linked antifreeze glycoproteins［J］.Journal of the American Chemical Society，2008，130（10）：2928-2929.

［41］TSVETKOVA N M，PHILLIPS B L，KRISHNAN V V，et al.Dynamics of antifreeze glycoproteins in the presence of ice［J］.Biophysical Journal，2002，82（1）：464-473.

［42］HEGGEMANN C，BUDKE C，SCHOMBURG B，et al.Antifreeze glycopeptide analogues：microwave-enhanced synthesis and functional studies［J］.Amino Acids，2010，38（1）：213-222.

［43］BOUVET V R，LORELLO G R，BEN R N.Aggregation of antifreeze glycoprotein fraction8and its effect on antifreeze activity［J］.Biomacromolecules，2006，7（2）：565-571.

［44］UDA Y，ZEPEDA S，KANEKO F，et al.Adsorption-induced conformational changes of antifreeze glycoproteins at the ice/water interface［J］.The Journal of Physical Chemistry B，2007，111（51）：14355-14361.

［45］ZEPEDA S，YOKOYAMA E，UDA Y，et al.in situ observation of antifreeze glycoprotein kinetics at the ice interface reveals a two-step reversible adsorption mechanism［J］.Crystal Growth and Design，2008，8（10）：3666-3672.

［46］GAUTHIER S Y，MARSHALl C B，FLETCHER G L，et al.Hyperactive antifreeze protein in flounder species［J］.FEBS Journal，2005，272（17）：4439-4449.

［47］MARSHALL C B，FLETCHER G L，DAVIES P L.Hyperactive antifreeze protein in a fish［J］.Nature，2004，429：153.doi：10.1038/429153a.

［48］MARSHALL C B，CHAKRABARTTY A，DAVIES P L.Hyperactive antifreeze protein from winter flounder is a very long rod-like dimer ofα-helices［J］.Journal of Biological Chemistry，2005，280（18）：17920-17929.

［49］OLIJVE L L C，SUN T，NARAYANAN T，et al.Solution structure of hyperactive typeⅠantifreeze protein［J］.RSC Advances，2013，3（17）：5903-5908.

［50］SUN T，LIN F H，CAMPBELL R L，et al.An antifreeze protein folds with an interior network of more than400semi-clathrate waters［J］.Science，2014，343：795-798.

Relationship between Structure and Antifreeze Activity in Fish Antifreeze Proteins

JI Ruiqing1，LIU Aiguo1，*，CHEN Long1，WU Zijian1，HU Zhaobo2，LIU Bin3
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin300134，China；2.Tianjin Food Research Institute，Tianjin301609，China；3.Tianjin Key Laboratory of Refrigeration Technology，Tianjin University of Commerce，Tianjin300134，China）

Antifreeze proteins，which possess strong antifreeze activity，can effectively inhibit ice growth and recrystallization by binding irreversibly to the ice crystal surface.The structural characteristics（including amino acid residues，specific sequences，secondary structure contents and protein spatial configuration）of six representative kinds of fish antifreeze proteins，important factors involved in stabilizing protein structure and amino-acid residue sites involved in ice binding are discussed in this paper.Much attention is focused on revealing the potential relationship between structure and antifreeze activity，and the purpose is to provide a theoretical basis for its widespread application in the future.

fish antifreeze proteins；structure；antifreeze activity；ice-binding property

R392.1

A

1002-6630（2015）05-0274-09

10.7506/spkx1002-6630-201505049抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP），又稱熱滯蛋白或冰結構蛋白，是生物機體為適應低溫或過冷的環境而在體內積累產生的一類蛋白［1］，具有很強的抗凍活性，即便在較低的濃度時（較NaCl、乙二醇等抗凍物質產生抗凍活性的物質濃度要低200～500倍［2］）也會產生有效抗凍活性，從而使得生物機體具有耐凍（freezetolerant）以及防凍（freeze-avoidant）的性能［3］。鑒于其獨特的功能，AFP可應用于細胞以及組織的低溫保存、制冷系統的冰漿、以及食物的貯藏等多方面。Bindslev-Jensen等［4］曾經研究AFP的過敏性，發現其與已知的過敏原無同源性，且加入AFP后無組胺釋放，表明AFP無過敏性，是一種安全的食品添加劑；2004年聯合利華公司將

2014-09-10

天津市科技計劃項目（14ZCZDTC00021）；天津市科技支撐項目（14ZCZDNC00016）

紀瑞慶（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：lmx9009@126.com

劉愛國（1964—），男，教授，碩士，研究方向為食品生物技術與食品添加劑。E-mail：liuaiguo@tjcu.edu.cn