HPLC-DAD法同時測定黃芪護肝丸中5種活性成分的含量

米振清，劉斌，2*

(1.山東省泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東 泰安 271000； 2.泰山醫學院，山東 泰安 271000)

·中藥工業·

HPLC-DAD法同時測定黃芪護肝丸中5種活性成分的含量

米振清1，劉斌1，2*

(1.山東省泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東 泰安 271000； 2.泰山醫學院，山東 泰安 271000)

目的：建立高效液相色譜法同時測定黃芪護肝丸中芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚5種活性成分含量的方法。方法：采用ZORBAX SB-C18色譜柱；流動相：甲醇(A)-0.1%磷酸的水溶液(B)，梯度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：芍藥苷為230 nm，橙皮苷和五味子醇甲為217 nm，大黃素和大黃酚為254 nm。結果：芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚的線性范圍分別為5.12～102(r=0.999 6)、10.4～207(r=0.999 8)、2.58～51.6(r=0.999 7)、3.22～64.4(r=0.999 8)、2.45～49.0 μg·mL-1(r=0.999 8)，平均加樣回收率(n=6)分別為98.6%、99.2%、98.9%、98.3%、98.3%，RSD分別為1.1%、1.0%、1.3%、1.2%、1.2%。結論：本法專屬性強，結果準確，重復性好，可用于黃芪護肝丸的質量控制。

高效液相色譜-二極管陣列檢測器；黃芪護肝丸；芍藥苷；橙皮苷；五味子醇甲；大黃素；大黃酚；含量

黃芪護肝丸是在中醫臨床驗方和現代中藥藥理學研究基礎上由黃芪、赤芍、陳皮、五味子、大黃等16味中藥組成的水丸，具有清熱解毒、益氣活血、保肝護肝之功能，用于甲肝或乙肝的治療。其中，黃芪具有補氣升陽、益衛固表的作用，其有效成分黃芪甲苷具有抗血栓、抗腫瘤、保肝等作用[1]；赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛的作用，其有效成分芍藥苷具有鎮痛、鎮靜、舒張平滑肌的作用[2]；陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰的作用，橙皮苷具有降脂、抗血栓、抗腫瘤等作用[3]；五味子具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的作用，其有效成分五味子醇甲具有保肝護肝，促進肝糖原合成等作用[4]；大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經、利濕退黃的作用，大黃素和大黃酚具有瀉下、抗炎、降壓、降血脂等作用[5-6]。目前對于上述幾種成分的含量測定方法的報道較多[7-14]，除黃芪甲苷的含量測定采用高效液相-蒸發光散射檢測器檢測外，其余成分的含量測定方法皆為高效液相-紫外檢測器檢測，且未見關于黃芪護肝丸多成分含量測定方法的研究。本研究以赤芍中的芍藥苷、陳皮中的橙皮苷、五味子的五味子醇甲、大黃中的大黃素和大黃酚為定量指標，根據5種成分紫外吸收特征的不同，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器檢查法，在3個紫外波長下同時對黃芪護肝丸中的5種成分的含量測定方法進行研究。結果表明，本法專屬性強，結果準確，重復性好，可為黃芪護肝丸的質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-M20A二極管陣列檢測器、LC solution色譜工作站(日本島津公司)；十萬分之一電子天平(Mettler Toledo XS205DU)。

1.2 試藥

芍藥苷對照品、橙皮苷對照品、五味子醇甲對照品、大黃素對照品、大黃酚對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110736-201438，110721-201316，110857-201010，110756-201110，110796-201319)；黃芪護肝丸(自制，每20丸重1 g，批號分別為20140801，20140802，20140803)；甲醇為色譜純；磷酸為分析純；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，35%A；10～15 min，35%～60%A；15～35 min，60%A；35～40 min，60%～80%A；40～60 min，80%A；60～65 min，80%～35%A；65～70 min，35%A)；檢測波長：芍藥苷為230 nm，橙皮苷和五味子醇甲為217 nm，大黃素和大黃酚為254 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。芍藥苷、橙皮苷、五味子醇苷、大黃素和大黃酚的分離度均大于1.5，理論板數按橙皮苷色譜峰計算應不低于6000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚對照品適量，分別加甲醇制成質量濃度分別為512、1036、258、322、245 μg·mL-1的對照品儲備液。再分別精密量取儲備液1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇制成每mL中分別含芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素、大黃酚51.2、104、25.8、32.2、24.5 μg的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品100丸，研細，混勻，取約2.0 g，精密稱定。置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率為300 W，頻率為50 KHz)30 min，取出，放冷，再稱定重量。用甲醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液 按黃芪護肝丸處方比例，分別制備不含赤芍、陳皮、五味子、大黃的黃芪護肝丸陰性樣品，按2.2.2項下的方法制備陰性供試品溶液。

2.3 空白試驗

按2.1色譜條件，分別取對照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液依法測定，記錄色譜圖。結果表明，供試品溶液中芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚的色譜峰與對照品溶液保留時間一致，陰性供試品溶液在與芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚對照品相同保留時間處無干擾峰，處方中其他藥味對測定結果無影響。HPLC圖譜見圖1～6。

注：1.芍藥苷；2.橙皮苷；3.五味子醇甲；4.大黃素；5.大黃酚。下同。圖1 對照品HPLC圖

圖2 樣品HPLC圖

圖3 缺赤芍陰性對照樣品HPLC圖

圖4 缺陳皮陰性對照樣品HPLC圖

圖5 缺五味子陰性對照樣品HPLC圖

圖6 缺大黃陰性對照樣品HPLC圖

2.4 線性關系考察

精密量取2.2.1項下芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚對照品儲備液各0.1、0.2、0.5、1、2 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成不同濃度的混合對照品溶液，依法測定。以質量濃度X(μg·mL-1)對峰面積Y進行線性回歸，回歸方程分別為芍藥苷：Y=3.879×104C+8.463×103(r=0.999 6)；橙皮苷：Y=2.168×104X+1.273×104(r=0.999 8)；五味子醇甲：Y=7.342×104X+5.732×103(r=0.999 7)；大黃素：Y=2.469×104X+6.056×103(r=0.999 8)；大黃酚：Y=3.096×104X+1.335×103(r=0.9998)，芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚的線性范圍分別為5.12～102、10.4～207、2.58～51.6、3.22～64.4、2.45～49.0 μg·mL-1。

2.5 精密度試驗

取2.2.1項下混合對照品溶液，按2.1色譜條件連續進樣6次，測定峰面積，以峰面積考察精密度，芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為0.62%、0.81%、0.63%、0.62%和0.70%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取黃芪護肝丸(批號：20140801)，按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，依2.1色譜條件進行測定，結果芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚的平均質量分數分別為0.98、2.2、0.50、0.68、0.50 mg·g-1，RSD分別為1.5%、1.4%、1.3%、1.3%和1.5%，表明該方法的重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取黃芪護肝丸(批號：20140801)，按照2.2.2項下方法制備的供試品溶液，依2.1色譜條件分別在供試品溶液制備后的0、2、4、6、8、10、12 h進行測定，結果芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為1.1%、1.5%、1.2%、1.0%和1.1%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.8 加樣回收試驗

取已知含量的黃芪護肝丸(20140801)適量，研細，稱取約1.0 g，共6份，精密稱定，分別精密加入2.2.2項下的芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚對照品儲備液2.0 mL，照2.2.2項下方法制備供試品溶液，依2.1色譜條件測定，分別計算各成分加樣回收率，結果見表1。表明該方法的準確度良好。

表1 加樣回收試驗結果(n=6)

2.9 樣品測定

取本品3批樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測定，用外標一點法分別計算樣品中芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黃素和大黃酚的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(n=3) /mg·g-1

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的考察

本研究分別采用超聲和回流提取方法，分別以甲醇、70%甲醇溶液、50%甲醇溶液為溶媒，分別超聲處理15、30 min以及加熱回流30、60 min，制備供試品溶液。比較發現，5種待測成分在甲醇溶液中超聲提取30 min提取效果較好，雜質干擾少，且操作簡便，節約時間。

3.2 檢測波長的選擇

由于5種成分的紫外光譜差異較大，為了能同時檢測5種活性成分，采用二極管陣列檢測器，多波長同時檢測各成分的含量。芍藥苷在230 nm處有最大吸收，且吸收值高，分離度好，故選擇此波長檢測；橙皮苷在207、284 nm處有特征吸收，且靈敏度高，無干擾峰；五味子醇甲在217、252 nm處有特征吸收，但均在217 nm處有較大吸收，因此選擇217 nm作為橙皮苷和五味子醇甲共同的測定波長；大黃素和大黃酚共有的特征吸收均為254、266、288 nm，因均在254 nm處有較大吸收，且靈敏度高，無干擾峰，因此選擇254 nm作為共同的測定波長。

3.3 流動相的選擇

筆者參照相關文獻[8-14]，分別比較了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液和甲醇-2%醋酸溶液3種不同的流動相。結果發現以甲醇-0.1%磷酸為流動相，采用梯度洗脫的方法，5種待測活性成分的峰形及分離度均良好，保留時間適宜。使用本法測定的專屬性強，結果準確，重復性好，可結合黃芪護肝丸中黃芪甲苷的含量測定方法綜合評價黃芪護肝丸的質量。

[1] 陳國輝，黃文鳳.黃芪的化學成分及藥理作用研究進展[J].中國新藥雜志，2008，17(17)：1482-1485.

[2] 冀蘭鑫，黃浩，李長志.赤芍藥理作用的研究進展[J].藥物評價研究，2010，33(3)：233-236.

[3] 李慶耀，梁生林.陳皮的藥用研究進展[J].中成藥，2008，30(2)：246-248.

[4] 王文燕，陳建光.五味子的藥理作用及開發研究[J].北華大學學報，2007，8(2)：128-132.

[5] 王磊，張靜澤，高文遠.大黃活性成分藥代動力學研究進展[J].中成藥，2011，33(9)：1571-1574.

[6] 李娟，李堅.大黃藥理作用研究及臨床應用概述[J].實用醫藥雜志，2006，23(9)：1132-1134.

[7] 劉浩文，劉嘉儀，楊妙榮，等.黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定的兩種方法的比較研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2011，22(6)：659-662.

[8] 周海玲，許舜軍，楊柳.HPLC法測定赤芍中芍藥苷的含量[J].臨床醫學工程，2011，18(4)：487-488.

[9] 孔銘，朱玲英，王佩娟，等.HPLC測定補腎活血顆粒中芍藥苷，阿魏酸，淫羊藿苷的含量[J].中成藥，2010，32(4)：600-603.

[10] 張月輝，王冬梅，王安達，等.HPLC法同時測定益胃口服液中芍藥苷和橙皮苷的含量[J].沈陽藥科大學學報，2007，24(8)：495-497.

[11] 徐海燕，金藝，張紅霞，等.HPLC同時測定胃力片中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量[J].中成藥，2010，32(8)：1355-1357.

[12] 倪琳，楊錫.HPLC法同時測定生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素[J].中成藥，2012，34(5)：872-875.

[13] 巫濤，顧明君.HPLC測定黃連上清膠囊中大黃素、大黃酚含量[J].中成藥，2005，27(4)：472-473.

[14] 王洪志，范俊婷，劉勇，等.HPLC法測定清胰片中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2008，14(9)：13-15.

SimultaneousDeterminationofFiveKindsofComponentsinHuangqihuganPillsbyHPLC-DAD

MIZhenqing1，LIUBin1，2*

(1.TaianTestingCenterforFoodandDrugControl，Taian271000，China； 2.TaishanMedicalUniversity，Taian271000，China)

Objective：To establish an HPLC method for determination of five bioactive components in Huangqihugan pills，including paeoniflorin，hesperidin，schisandrin、emodin and chrysophanol.Methods：A stable HPLC method was established on a ZORBAX SB-C18column，the mobile phase consisted of methanol (A)-0.1% (w) phosphoric acid(B) as mobile phase in a gradient mode.The flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was set at 30 ℃.The detection wavelength was set at 230 nm for paeoniflorin，217 nm for hesperidin and schisandrin，254nm for emodin and chrysophanol，respectively.Results：The linear ranges of paeoniflorin，hesperidin、schisandrin、emodin and chrysophanol were 5.12-102 (r=0.999 6)，10.4-207(r=0.999 8)，2.58-51.6(r=0.999 7)，3.22-64.4(r=0.999 8) and 2.45-49.0 μg·mL-1(r=0.999 8)，respectively.The average recovery were 98.6%、99.2%、98.9%、98.3% and 98.3%，repectively.RSD were 1.1%、1.0%、1.3%、1.2% and 1.2%，respectively.Conclusion：The established method is specific，accurate and reproducible，which can be used for the quality control of Huangqihugan pills.

HPLC-DAD；Huangqihugan pills；paeoniflorin；hesperidin；schisandrin；emodin；chrysophanol； content

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.022

2014-12-25)

*

劉斌，主管藥師，研究方向：中藥質量控制；Tel：(0538)8334565，E-mail：liubin8247@sina.com