分子探針：提速癌癥診斷的新工具

賀曉鵬

結構可控先進功能材料及其制備教育部重點實驗室，華東理工大學化學與分子工程學院，上海 200237

*論著——精準醫療*

分子探針：提速癌癥診斷的新工具

賀曉鵬

結構可控先進功能材料及其制備教育部重點實驗室，華東理工大學化學與分子工程學院，上海 200237

癌癥的快速、準確血液診斷是國際生命健康領域亟待解決的科學問題。然而，現有臨床診斷技術存在操作流程繁復、技術要求高、耗時長且成本昂貴等缺陷。發展可用于快速捕捉血液癌標志物的簡易、經濟型診斷新工具逐漸成為國內外學術研究熱點。分子探針具備構建簡易、響應快、成本低的優勢，其傳統應用領域為環境檢測與細胞、活體標記等。近年來，靈敏探測血液癌標志物的分子探針創制，形成了一個多學科交叉的新興領域。該文簡要綜述了相關領域研究團隊對此類分子探針的構筑策略，并結合相關癌標志物的“快速檢測”實例展現了探針的醫學潛能，旨在為分子探針的多元化發展提供新的研究思路，期待通過獨特化學技術與臨床醫學的有機結合，實現對癌癥血液診斷的提速和低成本化。

癌癥；血液標志物；分子探針；分子診斷；熒光

長期以來，癌癥嚴重威脅著人類的生命健康。由于人類對癌癥的發生、發展及復發機制尚未有系統性認識，而傳統的臨床手術、放化療法和近年興起的免疫治療技術尚需完善，癌癥仍是全球致死率最高的人類重大疾病之一［1］。癌癥的早期診斷與治療可顯著提高患者的生存期，但受臨床癌標志物特異性不高，尤其是現有癌檢測手段技術繁復、耗時長、原材料昂貴等局限，癌的精準、快速診斷仍是生命科學領域亟待解決的關鍵科學問題。因此，開發簡易、高效的癌癥診斷工具，對于癌患者的術前化驗、術中判斷和術后監控具有重要意義。

癌細胞所分泌特異標志物的血液化驗是目前大規模體檢的首選技術，它不但可規避磁共振與活檢等手段所帶來的輻射、肌體創傷與高成本，還可為癌癥的早期診斷提供高通量的普篩平臺。然而，現有臨床化驗技術（如酶聯免疫吸附測定、免疫發光、聚合酶鏈式反應等）具有一定的局限性，操作繁復（反復的孵育、封閉、擴增與洗滌步驟），耗時長且價格昂貴（需聯用多種成本較高的抗體、基因序列等生化試劑）。于是，發展可更高效、快速捕捉血液標志物的經濟型診斷工具，是當前學術界的研究熱點。

區別于傳統生化手段對待測物的標記需求，分子探針（即可用于研究與其余分子或結構相互作用的原子與分子）往往可“自帶”一種“關開信號”，可經由與待測物的共價或非共價作用產生一種“免標記”（即無需對待測物進行標記）的信號改變，從而實現對待測物的定量分析。這一檢測原理具備操作便捷、響應快、成本低等優勢。分子探針的傳統應用領域為環境檢測與細胞、體內（熒光）標記等［2］。隨著上述臨床診斷學問題的日益凸顯，構建可用于靈敏、快速捕捉血液癌標志物的分子探針，逐漸成為了一個獨特的交叉學科研究方向，為傳統的分子探針領域注入了新的活力。這一新興方向涉及化學、化工與材料學家對分子探針的設計加工，同時涵蓋生物與醫學家對探針的臨床實踐與優化指導，通過多學科協同創新為人類的生命健康謀求福祉。

基于上述學科背景，該文從分子設計、合成與材料復合組裝等方法學層面簡要綜述相關領域科研團隊對癌標志物分子探針的構筑策略，并結合其相關臨床樣品“快速檢測”實例展現此類探針的醫學價值，期待通過獨特分子工程技術與臨床醫學導向的有機結合，實現對血液癌標志物臨床診斷的提速。

1 分子探針構建及血清癌標志物檢測

1.1 分子探針構建策略概要

分子探針的組成主要包含一類可與待測物（生物小分子或大分子）產生特異相互作用的識別基團和一類可經由識別產生信號的報告基團。探針的作用模式可以是共價的化學反應，也可以是非共價的結合作用（圖1）：當識別基團與報告基團偶聯后，后者的信號被關閉，隨后經探針與標志物的快速結合打斷關閉機制，報告基團的信號被“開啟”。此外，還可通過分子組裝手段獲得材料復合型分子探針（圖2）：經由信號基團與一種特殊材料基底的組裝形成復合探針材料，隨后通過與標志物的識別產生信號。

圖1 小分子探針的標志物檢測原理Fig. 1 Detection mechanism of small-molecule probes for biomarkers

圖2 材料復合分子探針的標志物檢測原理Fig. 2 Detection mechanism of material-based molecular probes for biomarkers

1.2 小分子探針

α-酮戊二酸（α-KG）是體內代謝途徑中重要的氮素運載體之一，與急性髓樣白血病密切相關［3］。基于酮與肼的高反應活性，合成了含肼識別基團的熒光分子探針，通過分子內電荷轉移機制淬滅熒光。當α-KG與肼反應后，探針的熒光被選擇性開啟，進一步應用微流池體系［4］與脂質體包裹策略［5］實現了對血清中α-KG的快速定量（10-20 min；圖3a）。芳香胺N-乙酰轉移酶2（NAT2）主要分布于肝臟與結腸，其功能紊亂與多種癌癥相關［6］。為了屏蔽生物背景光，發展了一種可在近紅外波段（＞780 nm）發射熒光的分子探針，并引入芳香胺基團，通過電子轉移機制淬滅熒光。當NAT2對探針的芳香胺位點進行乙酰化修飾后，探針熒光在短時內顯著增強（圖3a），應用這一探針初步實現了對肝組織勻漿中NAT2的熒光檢測，將進一步驗證其臨床血液檢測能力［7］。此外，還發展了一種稀土元素（Tb3+）配位的芳香胺衍生物，當發生NAT2催化的乙?；饔煤螅结樋僧a生100倍的發光增強，且熒光壽命達到1 ms以上［8］。

除上述基于化學反應的分子探針，拓展了基于分子折疊的探針原型。環氧化酶-2（COX-2）的表達量可隨癌癥的進程而顯著提升，但在正常組織內極少表達［9］。將一種可與COX-2高親和力結合的抑制劑分子與熒光團通過長柔性鏈連接，構建了可在水環境中產生疏水折疊，并通過電子轉移機制淬滅熒光的分子探針（圖3b）。COX-2與抑制劑的結合可選擇性快速展開分子折疊（30 min），產生強熒光發射。此類分子探針被應用于癌細胞與正常細胞的區分［10］，以及癌組織、炎癥組織和正常組織的熒光辨別［11］，為熒光指導手術提供了新的方法，同時為癌患的COX-2血液檢測提供了便捷工具。核酸是重要的生命信息分子，許多核酸物質也被認為是有效的腫瘤標志物?；谶@一背景，設計合成了以多肽為核酸受體，含有雙芘基團的堆疊為激基締合物的折疊分子探針，通過與胞內核酸的結合，締合物折疊被打開，產生單個芘基的熒光［12］。進一步構建了一種光致變色型折疊探針，當探針折疊時無法通過光照對其進行結構調控，而與核酸結合后探針不但熒光發生增強，且光致變色性能被激活，為核酸標志物的檢測提供了多元化的信號輸出［13］。

聚集誘導發光（AIE）是指將弱熒光的分子通過聚集誘導熒光增強［14］。利用這一機制，將可靶向識別癌細胞標志物蛋白（如溶酶體蛋白跨膜β4等）的多肽與可發射紅光的AIE信號基團偶聯，實現了對癌細胞表面跨膜受體標志物的靶向、短時檢測（圖3c）［15，16］。應用相同原理，構建了一種酶剪切型AIE探針，通過堿性磷酸酶對探針磷酸化部位的剪切游離AIE基團，從而實現聚集發光，探針還被驗證可在血清中高靈敏檢測上述標志物［17］。此外，利用超分子組裝和多信號標記策略，實現了對肺癌潛在標志物神經激肽-1受體（NK1R）的血清檢測。設計了一種磁/光兩性的超分子多肽探針（圖3d），當探針與NK1R識別后可從二維結構解聚成一維結構，從而釋放熒光與磁性的雙重信號［18］。利用熒光信號實現了對肺癌細胞表面NK1R的選擇性標記，并進一步利用磁信號迅速地將肺癌患者的血清樣本從正常人群中分離出來（2 min），為肺癌的診斷試劑發展提供了新的思路。

圖3 小分子癌標志物探針工作原理示意圖Fig. 3 Detection mechanism of small-molecule probes for cancer biomarkers

1.3 材料復合探針與器件

癌細胞通常會表達及分泌一些特殊的糖蛋白與糖蛋白受體，可作為癌癥診斷的標志物。針對肝癌細胞表面脫唾液酸糖蛋白受體（ASGPr），設計構建了一系列熒光開啟型與電化學活性探針體系。石墨烯是一種單原子厚度的碳材料，其獨特的光電性能吸引了學術界廣泛的研究興趣［19］。利用石墨烯的熒光淬滅與分子富集效應，將糖熒光分子與石墨烯通過π-堆疊、靜電作用等有序自組裝，簡易構筑了糖鋪層分布，且熒光淬滅的石墨烯復合探針，應用此類探針實現了對于高表達ASGPr肝癌細胞的靶向特異性、短時熒光“關開”標記（30 min；圖2）［20］。進一步發現可利用糖與ASGPr識別后的內吞效應，構建具備細胞靶向性的糖分子探針，用于細胞內容物的選擇性探測［21，22］。還拓展應用此類熒光復合材料，實現了對阿爾茨海默癥鼠腦切片的快速“免清洗”標記，標記時間（30 min）比傳統免疫熒光標記技術降低24倍，標記成本降低1000倍［23］。同樣，基于石墨烯與硫磺素的復合材料，實現了對鼠腦脊髓液中老年斑的熒光標記與光熱治療，即利用石墨烯的近紅外光吸收性質，實現了此類材料對老年斑沉淀的降解［24］。

此外，構建了電活性基團標記的糖分子探針，并與一種石墨烯覆蓋的自制絲網印刷電極復合，通過簡便的電化學技術實現了對高表達ASGPr肝癌活細胞的靈敏捕捉［25，26］。值得注意的是，此類電化學器件僅需一臺可攜式電化學工作站聯用一臺個人筆記本電腦即可完成對癌細胞的檢測，為癌癥的家庭式小型化檢測儀器發展提供了研發思路。端粒酶可通過對DNA復制的修復增加細胞分裂次數，且在絕大多數癌細胞中表達，是一種潛在的癌標志物。構建了一種基于卟啉與石墨烯的復合電極，并實現了對低至十個癌細胞中端粒酶的定量［27］。此外，通過熒光“關開”的方法實現了對端粒酶的檢測，分別利用多孔硅納米顆粒［28］與納米金顆粒［29］為核心材料并負載熒光標記的核酸片段，得到熒光關閉的信號，隨后通過端粒酶對核酸片段的催化延長（增加熒光團與核心材料的間距）恢復被淬滅的熒光。近期探索研究中，制備了糖分子層覆蓋的金納米顆粒，并應用顆粒與凝集素之間的識別效應，構建了一種糖基金顆粒與凝集素聚合的超分子結構，進一步通過凝集素與肝癌糖蛋白類標志物甲胎蛋白異質體（AFP-L3）的競爭結合解聚超分子體系，通過聚合—解聚過程的吸收光信號變化實現了肝癌患者血清的快速診斷（5 min），并實現了肝癌與肝炎病患和正常人血清的準確區分（未發表成果）。修飾的金納米顆粒還可被用于監控肺癌病人所呼出的氣體癌標志物，為癌癥的快速、簡易診斷提供了獨特見解［30］。

2 結論與展望

隨著臨床需求的日益增長，發展可快速、準確對癌癥進行血液診斷的經濟型工具是當今多學科交叉的研究熱點。血液診斷的優勢在于規避影像學與組織活檢等技術對于人體的創傷，并可高通量地對大規模樣品進行篩查。然而現有技術存在操作繁、耗時長、成本高等顯著缺陷，且國外技術壟斷嚴重，于是發展我國自主知識產權的高效癌癥診斷工具迫在眉睫。該文簡要綜述了相關領域科研團隊近年來在發展癌標志物分子探針領域的研究進展。從小分子、超分子與材料復合探針等層面闡述了探針構建策略，進一步結合對癌標志物的檢測實例展示了分子探針的快速檢測性能。

分子探針的主要優勢在于構建簡易（合成與材料復合成本均低于現有生化試劑），免標記（無需對待測品反復免疫標記），尤其是響應快（最快幾分鐘內即可獲得信號），有望成為新一代的疾病診斷工具，實現快速和低成本的癌癥診斷。當然，目前所發展的分子探針原型仍有待系統性的臨床實驗驗證，作者對分子探針的未來發展方向作如下展望：

（1）實現分子探針體系的標準化制備，有利于導向我國自主知識產權診斷試劑盒的研發；

（2）緊密與醫學結合，進行臨床的“多中心、大樣本和雙盲”血液化驗，充分驗證探針的醫學價值；

（3）合理設立對照組，實現對于癌癥的精準、快速診斷。

致謝 感謝田禾教授對于本文的提議與審核

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《糖尿病新世界》是國家衛生和計劃生育委員會主管，全國衛生產業企業管理協會主辦的專業性學術期刊，中國核心數據期刊（遴選）數據庫收錄期刊、中國期刊全文數據庫收錄期刊、中文科技期刊數據庫收錄期刊。國內統一刊號：CN 11-5019/R；國際刊號：ISSN 1672-4062，郵發代號82-120，定價10元。

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Molecular probes： new-generation tools for the accelerated diagnosis of cancer

HE Xiaopeng
Key Laboratory for Advanced Materials & Institute of Fine Chemicals， School of Chemistry and Molecular Engineering， East China University of Science and Technology， Shanghai 20023

The rapid yet accurate diagnosis of cancer is a critical issue that poses a great challenge worldwide in the field of life science. However， current clinical biochemical techniques have flaws in terms of complicated conducting procedures， high technical requirement， long detection time and high cost. The development of simpler and more economic tools for the fast blood tests of cancer biomarkers has become a major focus of the academy. Molecular probes have merits in sensing applications owing to their conciseness in construction， fast response and low cost. Their conventional application areas involve environmental analysis and cellular/in vivo imaging. In recent years， the development of molecular probes suitable for probing cancer biomarkers has become a vividly new multidisciplinary research field. Here we summarize the construction strategies of these probes and highlight their diagnostic efficiency for cancer biomarkers. This article aims at spurring the diversification of simple and effective molecular probes for the detection cancer biomarkers， accelerating the progress of cancer blood tests by the combination of chemical techniques with medicinal science.

cancer； blood biomarker； molecular probe； molecular diagnosis； fluorescence

R730.58

A

10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.03.04

2015-07-30；

2015-10-01

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2013CB733700）

賀曉鵬，副研究員，研究方向為醫學導向的化學糖生物學，電子信箱：xphe@ecust.edu.cn

引用格式：賀曉鵬.分子探針：提速癌癥診斷的新工具［J］.世界復合醫學，2015，1（3）：207-211