基于核酸的疾病診斷技術新進展

彭雙，李娓，田沺，周翔

武漢大學化學與分子科學學院，武漢430072

基于核酸的疾病診斷技術新進展

彭雙，李娓，田沺，周翔

武漢大學化學與分子科學學院，武漢430072

隨著現代生活品質的不斷提升，疾病早期診斷的重要性日益凸顯，因此越來越多研究工作致力于發展新的疾病診斷技術?！熬珳梳t學”的提出，為新技術的發展提出了更高的要求，也代表著人們更高的期盼。在“精準”的道路上，化學生物學，小分子作為探針，用于生命體系內重要生物靶標的檢測與功能調控，已成為生物與醫藥領域發展的新的趨勢與方向。與此同時，核酸作為遺傳物質，其結構、功能、化學修飾等，皆與基因表達、蛋白質的合成、細胞信號轉導等重要生命過程密切相關。因此，核酸相關的生物靶標具有重大研究價值，對于重大疾病的機制研究，創新藥物的開發，疾病診斷等有重要意義。這里，我們將對適配子技術和一些核酸相關重要靶標，如核酸表觀遺傳修飾、循環miRNA等的化學法檢測這幾個方向的新進展，進行討論和總結，為后續研究工作提供參考。

核酸；疾病診斷；適配子；核酸表觀遺傳修飾；循環miRNA；檢測

在生命健康備受關注的今天，重大疾病的早期診斷越來越成為人們迫切的需求，因此也成為了科學家們積極追求的目標。隨著人們對生命科學的不斷探索，許多重大疾病的發病機制正在被逐漸闡明，尤其是核酸這個遺傳物質，在眾多重大疾病發生發展過程中所扮演的重要角色，正在得到越來越廣泛的認識［1］。與此同時，化學生物學是近幾十年發展起來的交叉領域，其利用化學法及小分子來干預一些重大的生命過程［2］，以研究相關作用機制，從而對重要生物靶標進行靶向和功能調控，最終為臨床醫學服務。與傳統的生物學方法相比，化學法更為靈活多變，探針設計更易控制，成本也相對較低，因此已經被廣泛用于生物分子的研究［3］。

正是這些理論與技術的創新，使得基于核酸的疾病早期診斷以及在此基礎上的靶向治療成為可能，以此為目標的科學技術和理論研究也蓬勃發展起來，并且在此基礎上，提出了精準醫學［4］。所謂精準醫學，既包括精準診斷，又包括精準治療。精準，換言之也就是靶向性和特異性，此外簡單和快速也是基本前提。關于靶向性和特異性，除抗體以外，適配子是一個理想的選擇，且由于其易修飾、易調控、廉價易得的特性，正在被越來越廣泛的應用于各種疾病相關生物靶標的檢測［5］。精準醫學的所謂精準，另一層面上意味著個體化的診斷或治療，即在了解不同個體基因組信息的基礎上，設計的具有針對性的診斷和治療方案。這個前提是基于測序技術的突飛猛進和價格的不斷降低。

與此同時，近年來核酸表觀遺傳修飾研究的興起［6］，告訴大家，影響人體疾病發生的，除了基因組信息的改變之外，還有表觀遺傳信息的改變［7］。因此發展高效、高選擇性的方法，用于各種核酸表觀遺傳修飾的檢測和表觀遺傳信息圖譜的繪制，對于疾病的早期診斷至關重要。此外，隨著研究的不斷深入和拓展，核酸家族中，一些曾經被忽略的成員，主要包括各種非編碼的核酸，它們的重要功能被發現。這引起了人們極大的興趣，包括研究它們與各重大疾病的相關性，在疾病發展中所起的功能以及針對它們的特異性檢測。

1 適配子技術在重大疾病診斷及治療中的應用

適配子是人工合成的單鏈寡核苷酸（ DNA 或RNA），能夠與靶物質進行高特異性與親和性地結合［8］，其功能類似抗體，但比抗體具有更多的優勢。它可以通過指數富集的配體系統進化技術進行體外篩選、擴增和富集。這項技術最早源于1990年Gold課題組［9］和Szostak課題組［8］的研究，他們分別從人工合成的隨機寡核苷酸庫中篩選得到了特定靶標的寡核苷酸配體，并命名了這項技術，篩選得到的靶物質的相應寡核苷酸配體則是所謂的適配子。適配子技術是基于包含隨機序列文庫的設計和多輪文庫與靶標相互作用、洗脫、擴增、再相互作用這樣一個循環操作，來達到適配子對靶標的高選擇性和高親和力，以及其針對不同類型靶標篩選的廣泛的適用性。同時，體外篩選的操作過程也更簡單可控。由于適配子本質上是一段寡核苷酸鏈，因此各種修飾、偶聯簡單易行，這為其在診斷醫學及靶向藥物輸送方面的應用，提供了廣闊的空間。目前研究和應用最多的適配子主要有凝血酶thrombin的適配子TBA［10］、進入二期臨床的抗腫瘤活性適配子AS1411［11］、細胞特異性的適配子sgc8［12］等等，以及它們各自的衍生化適配子序列。目前的研究主要致力于將這些經典的適配子通過化學修飾，與熒光團、納米材料、藥物分子等偶聯在一起，實現活體檢測或可控藥物釋放的目的。

1.1 適配子技術在重要生物靶標檢測中的應用

適配子作為一個核酸分子，其與靶標的結合通常依賴于特定構型的形成和穩定，例如莖環結構、G-四鏈體等，因此，適配子用于特定靶標的檢測通常是基于其與靶標相互作用前后，構型變化導致信號單元發生變化而輸出檢測信號［13］。這方面的例子有很多，例如早期凝血酶的適配子TBA發現后，結合納米粒子或熒光小分子作為探針，用來檢測凝血酶。又如ATP、金屬離子、可卡因等這些小分子的適配子篩選出來后，結合分子信標、量子點等設計，也被用于這些生物分子的檢測［14］。近年來，適配子在生物靶標檢測中的應用更為廣泛，并且探針體系的設計更為多元化，常常是與新材料、新的分析技術結合在一起，作為復合體系，例如顯色體系、電化學檢測體系、熒光體系、質量響應體系等，以達到靈敏度更高的檢測，以及在活體內的應用［13］。

適配子與納米材料相結合最大的優點就在于，多種納米材料都可以通過內吞而進入細胞，這樣適配子可以輕易被攜帶進入細胞，這是適配子用于活細胞內的檢測或診斷的前提。最近就有報道一個基于石墨烯的檢測體系，如下圖所示（圖1），能同時在細胞內檢測ATP和GTP［15］。ATP、GTP這類小分子的適配子很容易篩選得到，也容易被熒光標記，它們通過π-π堆積，就可以與石墨烯結合，同時熒光被淬滅。當進入細胞后，與各自的靶標作用后會脫離石墨烯，并產生熒光恢復。由于石墨烯的應用已較為成熟，因此該體系從簡單、廉價及能在活細胞內應用等角度來看，都具有臨床應用的前景。

圖1 基于適配子的石墨烯檢測ATP、GTP示意圖［15］Fig.1 Schematic illustration of in vitro and in situ molecular probing in living cells by using the aptamer/GO-nS nanocomplex

最近，譚蔚泓教授課題組結合適配子和MnO2nanosheet，構建了一個熒光/磁共振雙重響應的檢測平臺，用于腫瘤細胞成像［16］。如下圖所示（圖2），在這個體系中，適配子sgc8是作者前期篩選得到的細胞適配子，其具有G-四鏈體的二級結構，通過調控這種結構的形成和打開，已經被應用到多個藥物釋放體系，進行靶向藥物釋放。這里，納米體系與細胞的相互作用就依賴于sgc8與細胞表面受體的作用。而納米體系選擇的是可被還原的MnO2nanosheet，其被還原成為Mn2+后，可用于磁共振造影。同時這種nanosheet又可以作為適配子的運載工具，以及熒光團的淬滅劑。這樣多重的功能使得這個體系可以成為熒光和磁共振雙重響應的細胞成像體系：熒光響應來自于熒光標記的適配子，其被MnO2nanosheet荷載，且熒光被淬滅，通過內吞進入細胞后，在MnO2nanosheet被細胞內GSH還原而瓦解后，自然而然釋放出來，并恢復熒光；磁共振響應來自MnO2nanosheet被還原后產生的Mn2+。熒光和磁共振用于細胞成像各有優勢，一個靈敏度高，一個組織穿透力強，因此，這個報道中，兩者的結合，使得這兩個優勢結合在了一起。

圖2 基于適配子和MnO2 nanosheet的熒光/磁共振雙重響應的檢測平臺［16］Fig. 2 Activatable fluorescence/MRI bimodal platform for tumor cell imaging via MnO2 nanosheet-aptamer nanoprobe

適配子也被用來檢測循環腫瘤細胞。循環腫瘤細胞檢測是近年來研究領域和臨床診斷的一個熱門課題，由于其對于預后評估十分重要，因此大量研究工作致力于開發更靈敏、簡單的循環腫瘤細胞檢測體系。傳統基于抗體識別的循環腫瘤細胞檢測和捕獲方式較為費時費力，而基于細胞適配子技術篩選出來的特定腫瘤細胞的適配子，提供了簡單廉價且特異性良好的循環腫瘤細胞識別基礎。如下圖所示（圖3）的這個例子，適配子選用針對腫瘤細胞標志物CD30 biomarker的適配子，并設計成為一個帶有熒光團和淬滅團的發夾結構［17］。當適配子識別其相應的位于腫瘤細胞表面的特定受體時，其通過受體介導的內吞可進入細胞，隨后會進入溶酶體，在低pH的溶酶體中，這個適配子探針可以被降解，隨之產生被單個的熒光標記堿基，而熒光釋放。這個體系檢測循環腫瘤細胞可以在全血或穿刺組織中完成，而且背景極低，幾乎無脫靶效應，較抗體更靈敏。

圖3 適配子用于檢測循環腫瘤細胞［17］Fig. 3 Schema of the tumor cell-activatable aptamer-reporter for one-step assay of circulating tumor cells （CTCs） in a whole blood sample

圖4 納米孔用于凝血酶檢測［18］Fig. 4 Protein detection by nanopores equipped with aptamers

適配子的應用不僅通過與各種新型納米粒子結合實現，近年來也被引入到納米孔的設計體系中。納米孔是近年來開發的一種新型納米材料，被成功用于許多靶物質的單分子檢測，檢測的信號通常是源于單個待測靶物質分子通過納米孔材料時，與納米孔作用而產生的電信號變化。而納米孔被用于檢測蛋白時，由于蛋白較大，通常不易穿過孔道，因此常常是通過各種設計，將孔道外結合某待測靶標產生的變化，轉變為孔道內的某種改變，從而產生電信號變化。最近有報道，將核酸適配子通過特定的DNA接頭固定到納米孔的入口處，由于適配子可選擇的范圍非常廣，可以是任意靶標的適配子，因此這種納米孔的體系可以用于廣泛的生物靶標檢測。下圖（圖4）所示的是將凝血酶適配子TBA序列固定到納米孔的入口處，用于檢測凝血酶［18］。這里用于連接納米孔和TBA的DNA接頭是一條18nt 的單鏈序列OligoA，通過二硫鍵與納米孔相連。適配子TBA序列通過設計成能與OligoA雜交的aptamerT4，而與納米孔關聯起來。待測物質凝血酶加入后，可導致電信號的增加。

1.2 適配子在藥物靶向釋放中的應用

適配子除廣泛用于各種生物靶標的檢測或成像外，還有很多時候被用在靶向藥物釋放中，或者有些適配子本身就具有抗腫瘤活性，而作為潛在抗腫瘤藥物。作為藥物釋放工具的適配子，通常都是利用其特定的二級結構，作為藥物的載體，在細胞內環境中，低pH或還原性環境，適配子結構打開或被降解，而使得藥物釋放出來。有時適配子結合多孔材料，像蓋子一樣將藥物封閉起來，在特定細胞內環境中被打開，而釋放藥物。

圖5所示的是一個基于轉鐵蛋白受體的RNA適配子的藥物釋放體系，適配子結合DOX和一個針對NF-κB的抑制劑，在細胞內同時釋放這兩種藥物，起到協同的抗腫瘤效果［19］。在適配子體系的設計中，該文在轉鐵蛋白適配子的基礎上增加了一段雙鏈的尾巴，用來與DOX結合，這樣成功的增加了DOX的荷載量。而針對NF-κB的抑制劑是一段雙鏈DNA，叫做NF-κB decoy，它被通過二硫鍵連接在適配子尾巴的5’-端，這成功解決了NF-κB decoy不易進入細胞的問題。在細胞內環境中，二硫鍵可以順利被還原而斷開，使得NF-κB decoy釋放出來。

圖5 基于適配子的DOX、NF-κB抑制劑雙重藥物釋放體系［19］Fig. 5 Aptamer-mediated codelivery of doxorubicin and NF-κB decoy

基于適配子的藥物釋放體系設計非常豐富多樣，早些時候，譚蔚泓課題組設計了一個自組裝的3D DNA納米結構（圖6）［20］。在這個DNA納米結構中，包含有適配子、抗腫瘤藥物、反義核酸等多種要素，是這個體系具備靶向性和抗腫瘤活性雙重功效。如下圖所示，負責攜帶適配子、抗腫瘤藥物、反義核酸的功能區域，被設計組裝成Y形的結構，并通過雜交，與一個X形的connector結合，形成構成3D DNA納米結構的單元。這些結構單元通過光交聯可以形成最終的3D結構，它可以通過適配子與癌細胞表面相應受體的作用，而被內吞進入細胞。這個體系構建之后，作者用其同時荷載DOX、適配子sgc8、針對P-糖蛋白（P-gp）的反義核酸MDR1，達到了提高藥物荷載量和靶向性，降低腫瘤細胞產生化療藥物抗性的復合療效。這個體系的構建具有廣泛的應用范圍，可以結合不同適配子、不同藥物等其他元素，組裝成針對各種癌細胞的活性體系。

圖6 基于適配子的自組裝體系［20］Fig. 6 A multifunctional aptamer-based DNA nanoassembly for targeted cancer therapy

2 化學法用于核酸表觀遺傳修飾的檢測

表觀遺傳現象和相應的理論是經典遺傳學的有益補充和擴展，其與生命體的生長、發育，眾多疾病的形成、發展，甚至癌癥等重大疾病有著密切的關系，因此近年來，引起了學術界越來越多的關注。隨著認識的不斷深入，所謂表觀遺傳，這些堿基順序改變以外的基因改變，以及組蛋白翻譯后修飾和非編碼RNA等，已被普遍認為在生命體系中扮演者至關重要的作用［21］。最近研究發現，這些表觀遺傳修飾不僅可遺傳，同時也是可逆的。因此，對于它們的靶向和調控，在疾病診斷和治療以及藥物開發方面更具意義。

由于胞嘧啶羥甲基化（5hmC）、醛基化（5fC）、羧基化（5caC）等新的胞嘧啶氧化產物的發現［22］，曾用于5mC特定位點檢測的經典方法重亞硫酸鈉法，不能完全滿足對各種胞嘧啶氧化產物的區分，抗體及特異性的酶也沒有發展完善，因此化學法及小分子探針的發展成為了熱點問題。在化學法和有機小分子用于5mC的定性、定量及在全基因中的圖譜繪制方面，Okamoto， A.［23］，［24］、Carell， T.［25］、王樹［26］、周翔［27，28］等在前期均有大量工作報道。這里我們重點介紹5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）的化學法檢測。

對于5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）的化學法選擇性標記，目前主要的途徑有幾種，一是利用β-糖基化轉移酶β-GT將5hmC上C5羥基糖基化修飾，然后通過click反應偶聯親合標簽，進行富集和測序分析［29］；二是將其氧化成醛基，再進行檢測分析［30］。由于糖基化酶轉移葡萄糖的反應，對于CpG上羥甲基化位點對稱分布的情況效率不高，這帶來前一種策略在分析一些高5hmC分布樣本時的一些問題。此外，測序分析雖然能達到單堿基分辨率，但由于其中涉及到的酶較為昂貴，因此實驗成本仍然較高。最近，Ebenstein， Y.等在該策略基礎上，發展了一個熒光檢測體系（如圖7所示），將此前用于富集的親合標簽生物素換成熒光團Cy5，從而將富集測序分析轉變為直接熒光檢測［31］。這個體系對于全基因水平上5hmC的定量是有效的，并且將這個體系植入芯片上，可以做到較高通量的檢測，具有較好的實際應用前景。

圖7 基于糖基轉移酶的熒光標記體系［31］Fig. 7 Spectroscopic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.

除了上述通過β-糖基化轉移酶，轉移疊氮基標記的糖環至5hmC的羥甲基上，作為后續富集或熒光標記的反應位點，Bayley，H.等發展了另一種直接對5hmC上羥甲基進行化學修飾的方法，實現在非酶反應條件下，對其簡單高效的生物素或熒光團標記，并結合納米孔技術，達到了對基因組中5hmC的單分子檢測 （圖8）［32］。該體系利用的是亞硫酸氫鈉介導的巰基取代反應，將5hmC中羥甲基轉化為巰基化物，而生物素或熒光團則通過與巰基化物偶聯，而間接的與5hmC相連。這里所用的巰基化物為含有巰基的氨基酸，即GSH或半胱氨酸，它們除巰基外，也含有易于發生衍生化反應的胺基及羧基取代基，有利于進行多種功能化修飾。在低濃度亞硫酸氫鈉42 ℃、pH 5.0反應條件下，5hmC上羥甲基先生成的exo-甲烯基中間體，再與巰基親核試劑發生加成及消除反應，最終生成巰基取代物。另一方面，由于GSH及半胱氨酸上都有能與生物素或熒光團反應的胺基，因此，通過經典的胺基與羧基化物的偶聯反應，就可以實現多樣化的化學修飾。這個巰基取代反應的應用很大程度上減小了之前β-糖基化轉移酶反應體系的成本和操作的復雜性。

在氧化策略方面，Balasubramanian S.等首先用高釕酸鉀氧化的策略結合亞硫酸氫鈉法，實現了基因組水平上對5hmC單堿基分辨率的測序分析［30］。但這種方法需要進行差減分析，來區分5mC與5hmC，這一方面增加了實驗操作和背景信號，另一方面對樣本量也有較高要求。

圖8 亞硫酸氫鈉介導的巰基化物標記5hmC體系［32］Fig. 8 Single-molecule detection of 5-hydroxymethylcytosine in DNA through chemical modification and nanopore analysis

周翔教授課題組發展了氧化法結合熒光探針分子的策略，實現了對5hmC的熒光標記 （圖9）［33］，在對特定位點進行5hmC的判斷時，僅通過凝膠電泳掃描成像就能分辨。研究中，采用更溫和的氧化劑二氧化錳，將5-羥基胞嘧啶氧化為5-醛基胞嘧啶［34］，隨后只需選擇合適具有高反應活性的帶胺基熒光團與之偶聯，即可實現其熒光標記。在用于長鏈DNA中5hmC測試分析時，發現二氧化錳氧化效率只能達到50%，這可能限制其在基因組樣本檢測中的應用。不過只要將氧化劑換為氧化效率更高的高釕酸鉀，我們熒光小分子標記的策略仍然有效。熒光標記的方法最大的優點是可以通過熒光強度的測定，進行5hmC在基因組中的定量分析。由于越來越多的文獻報道5hmC在基因組中的水平與一些疾病，如糖尿病、腫瘤相關，通過我們開發的熒光小分子標記策略，實現對臨床樣本進行高效簡單的5hmC水平分析，意義十分重大。

圖9 熒光小分子檢測5-羥甲基胞嘧啶［34］Fig. 9 5-hydroxymethyl cytosine detection through direct chemical modification

上述方法通過熒光小分子直接標記修飾堿基，檢測可以通過凝膠電泳直觀地定性觀察，也可以通過測定熒光強度定量分析。與此同時，基于熒光共振能量轉移（FRET）的熒光標記體系，是另一個常用的生物靶標定量檢測的體系，其高靈敏度及低背景的特點均使其被廣泛應用。周翔教授課題組發展一種基于FRET的熒光檢測體系 （圖10），結合以上高釕酸鉀氧化策略，檢測5-羥甲基胞嘧啶［35］。FRET體系采用前期文獻報道的陽離子熒光聚合物（CCP），其與DNA相互結合的性能，及與熒光標記dNTP發生FRET的性質。我們先用高釕酸鉀將5-羥甲基胞嘧啶氧化成5-醛基胞嘧啶，5-醛基胞嘧啶與前期發展的帶羥胺的BODIPY化合物發生反應，從而標記上熒光，進而與陽離子熒光聚合物（CCP）發生FRET。通過檢測FRET熒光強度可定量檢測DNA中 5-羥甲基胞嘧啶的含量，該方法成本低、簡單、快速，并且定量檢測時，線性范圍較寬。

最近，袁必鋒教授課題組發現一個小分子化合物2-bromo-1-（4-dimethylamino-phenyl）- ethanone （BDAPE）如下圖11 結構所示，其能與胞嘧啶堿基反應成環，結合液-質聯用檢測技術，不同種類的胞嘧啶表觀遺傳修飾與之反應后，在質譜圖上顯示不同的分子離子峰［36］。這里，小分子化合物BDAPE的應用，將幾種胞嘧啶修飾在液相色譜中的差異大大提高，原本由于含量低、保留時間接近，而無法分開的幾種胞嘧啶修飾，在被小分子修飾后，能在液相色譜中被明顯區分開來，隨后通過質譜就可以鑒定其種類。由于質譜檢測一個顯著的優點在于靈敏度高，因此，這種方法可以檢測這些在細胞中含量極低的胞嘧啶表觀遺傳修飾。對于5-mC， 5-hmC， 5-foC及5-caC，檢測限分別能達到0.10， 0.06， 0.11， 0.23 fmol。雖然這個質譜檢測體系無法實現基因組水平上的特定位點檢測，但對于整體上的定量分析卻是切實可行的，對于不同樣本，包括動物組織，植物等各種樣本的全基因胞嘧啶表觀遺傳修飾定量分析十分有效。

圖10 FRET原理用于DNA中5-羥甲基胞嘧啶的檢測［35］Fig. 10 Fluorescent strategy based on cationic conjugated polymer fluorescence resonance energy transfer for the quantification of 5-（Hydroxymethyl） cytosine

圖11 化學修飾結合質譜技術的各種修飾胞嘧啶檢測體系［36］Fig. 11 Determination of 5-Methylcytosine and its oxidation products by chemical derivatization coupled with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

3 循環miRNA及其檢測

MiRNAs是一類長度為18～25nt的非編碼RNA，通過與靶mRNA作用降解或者抑制轉錄來調控基因表達。越來越多的研究證明miRNAs在癌癥的引發、生長、轉移過程中發揮著重大作用［37-40］。而循環miRNA是一種穩定性更好的RNA分子，在經過反復的凍融、極端的pH環境、長時間在室溫存儲等條件下依舊表現出良好的穩定性。它在體內的發現，最早見于Chim等在孕婦血漿中發現胎盤miRNAs（miR-135b， miR-141， miR-149， and miR-299-5p等）［41］，自此揭開了身體細胞分泌和釋放miRNAs的帷幕。接下來科學家們在各種體液（血清、血漿、唾液、眼淚、乳汁和尿液）中發現了一些miRNAs。這些胞外miRNAs和分泌miRNAs，總稱脫細胞miRNAs（cell free miRNAs）或循環miRNAs（circulating miRNAs）。循環miRNA并不是裸露的RNAs而是和蛋白質（比如Ago-2蛋白，Ago-2蛋白是RISC的主要組成成分）相結合。這些蛋白在cfmiRNAs的具有調控細胞間通訊的作用，而細胞間通訊對于靶細胞的miRNA庫具有重大影響［42-44］。總的來說，miRNAs與蛋白形成復合物能增加其在體液中循環時的穩定性。

循環miRNA進入體內可能有三種方式（1）凋亡或壞死細胞的被動釋放（2）微泡的主動釋放（3）非微泡的RNA結合蛋白依賴的主動釋放［45］。在過去的幾年里，越來越多的文獻已經證實 miRNA的表達在正常細胞與癌細胞中存在顯著差異。這使得miRNA作為腫瘤診斷及預警標志物成為可能。最近的一些發現表明，癌細胞與正常細胞一樣，也有能力將miRNAs分泌到細胞外環境，這一特點被認為與腫瘤性癥狀是相關的。循環miRNA在腫瘤中的作用還不甚明確，有待進一步研究，但目前認為它們可能與腫瘤轉移有關，同時也可能對遠端器官有作用。

鑒于循環miRNA的重要性，人們曾經關注的miRNA檢測逐漸延伸到了循環miRNA上。循環miRNA的檢測，本質上和常規miRNA的檢測沒有區別，因此早期發展的miRNA經典檢測方法，如 qRT-PCR［47-49］， 基因芯片［50-52］，RNA測序［53-57］等，仍然是循環miRNA檢測的主要方法，差異主要來自于循環miRNA更低的含量，以及相較普通miRNA更復雜的存在環境。對于循環miRNA而言，最理想的檢測體系應該是能夠實現原位檢測，因為額外的提取步驟對于存在于血液或其他體液中的循環miRNA來講，有更多不好的影響存在。因此，在新的檢測體系設計中，除了需要注意靶標miRNA之間高度的同源性、鏈長較短等問題外，體系的抗干擾能力也是設計的要點。這里，我們介紹一些最新報道的循環miRNA檢測體系。

圖12 循環miRNA進入體液方式1）miRNA形成RISC行使其調控基因表達的功能 2）以多泡體（MVB）的方式進入體液 3）以微觀粒子的自由形態進入體液 4）miRNA與蛋白結合進入到體液［46］Fig. 12 Three modes of circulating miRNAs’ entering to body fluid

3.1 電化學檢測

已經報道了很多電化學方法檢測循環miRNA，這些方法基于核酸雜交，已有綜述總結［58，59］。2014年，Mahmoud Labib等人［60］報道，在電極表面修飾捕獲序列，加入目標miRNA和亞甲藍分子標記的核酸探針，一起孵育后洗去未雜交結合的探針，葡糖氧化酶氧化檢測電信號，如圖13。

圖13 基于鏈雜交電化學檢測方法示意圖［60］Fig. 13 Protein electrocatalysis for direct sensing of circulating microRNAs

圖14 結合DSN酶電化學方法檢測循環miRNA［61］Fig. 14 Electrochemical biosensor for direct detection of microRNAs in serum

2014年，Yuqian Ren等人［61］報道了應用DSN酶（特異性識別DNA/RNA雜交鏈中的DNA鏈，并將其切割），在金納米電極表面修飾捕獲miRNA的序列，當有miRNA存在時與捕獲序列結合，DSN將雜交鏈中的DNA切斷，miRNA釋放后有可以跟新的捕獲序列結合，起到循環信號放大的作用。當有miRNA存在時，電極上的捕獲序列被切割，與完好的的電極相比，由于電化學阻抗作用產生電化學信號的差別，無需標記，如圖14。

3.2 光學傳感器檢測循環miRNA

光學傳感器檢測循環miRNA今本上通過設計DNA探針與miRNA作用使得熒光信號或者紫外吸光度產生變化去檢測出miRNA。已有的一些光學傳感器方法［62-64］雖然還沒有應用到循環miRNA的檢測當中，但具有巨大的潛力。

2014年，See-Lok Ho［65］等人報道用全內反射熒光（TIRF）成像技術檢測分析循環miRNA，TIRF是一種研究單分子的有力工具。他們將鎖核苷酸應用到分子信標中，可以提高檢測特異性，分子信標通過FRET效應熒光是淬滅的，當與miRNA作用時熒光信號恢復，通過TIIRF觀察熒光強度可以得到miRNA的濃度，如圖15。

3.3 納米材料類傳感器

納米材料具有其特殊的性能，應用到miRNA的檢測中具有很好的效果。Mustafa Salih Hizir等人［66］應用納米石墨烯，熒光標記的寡核苷酸序列可以吸附到納米石墨烯表面，并且熒光信號被淬滅，當有miRNA存在時，寡核苷酸和miRNA由于堿基互補配對作用形成雙鏈，從納米石墨烯表面釋放下來，熒光恢復，根據熒光信號的強弱檢測miRNA的濃度，如圖16。

本文就適配子技術和核酸胞嘧啶羥甲基化的化學法檢測，這兩個方面做了一些介紹和討論。適配子作為一種靶向性的分子，發展到現階段，更多的工作是集中在其與各種材料，分析技術相結合，作為檢測和載藥應用的工具。適配子技術也存在一些問題，例如穩定性的問題。適配子通常具有一些二級結構，而二級結構往往易受環境影響，這無論在篩選過程中，還是做衍生化進行應用的過程中，都會產生一些問題，可能還會帶來實驗的假陽性或假陰性。所以現在也有研究工作，通過化學修飾，進一步增強適配子在細胞中的穩定性，使其更好地用在診斷和治療中。

圖15 TIRF方法觀察熒光信號檢測循環 miRNA［65］Fig. 15 Direct quantification of circulating miRNAs in different stages of nasopharyngeal cancerous serum samples with Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

圖16 結合納米石墨烯的淬滅效果檢測循環miRNA［66］Fig. 16 Simultaneous detection of circulating oncomiRs from body fluids for prostate cancer staging using nanographene oxide

而核酸胞嘧啶羥甲基化的化學法檢測，主要是發展一些有機小分子或有機化學反應，選擇性的將5-羥甲基化胞嘧啶與其他胞嘧啶形式分開，進一步結合測序或電泳等方法，將這些表觀遺傳學的信息繪制出來。在這方面，化學反應的選擇性和反應產率往往是決定其能否廣泛應用的關鍵，此外，反應條件是否溫和，也是實際應用的前提。

對于循環miRNA的檢測，難度在于開發適用于復雜環境下的原位檢測方法，而避免復雜的miRNA提取過程。此外，結合使用肽核苷酸（PNA）和鎖核苷酸（LNA）等修飾核酸的探針可大大提高檢測體系的靈敏度和特異性。納米材料的應用也是一個不錯的選擇，在未來將納米材料應用到循環miRNA可以實現高靈敏度和分布式檢測，但是他的缺點是納米材料檢測響應時間長于溶液檢測體系。毋庸置疑，這幾個方向都是化學生物學的重要方向，隨著不斷的探索，它們都將為疾病診斷技術的提升提供有利的支持。

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《中外醫療》稿約

《中外醫療》是由國家衛生和計劃生育委員會主管，衛生部醫院管理研究所主辦的專業性學術期刊，中國核心數據期刊（遴選）數據庫收錄期刊、中國期刊全文數據庫收錄期刊、中文科技期刊數據庫收錄期刊。國際刊號：ISSN 1674-0742，國內統一刊號：CN11-5625/R，郵發代號：80-541。

本刊服務于醫學創新研究，以醫療事業改革和廣大醫療工作者探究學習，增強醫德，提升醫術為主旨，努力體現專業性、學術性、權威性，貼近實際，追求實用。本刊長期面向全國征集醫學學術論文，在本刊發表的論文可獲得國家繼續教育學分。

《中外醫療》雜志為半月刊，大16開，每月15日、25日出版，定價15元。

主要欄目： 院長論壇、創新視點、臨床研究、病例（案）探析、名醫名院、治院方略、管理之窗、后勤服務、醫藥互動、法規在線、醫院文化、護理天地、影像特析、綜合醫學、中醫中藥、衛生防疫、婦幼保健、特室特科、論著、綜述等。

聯系電話：010-63385386

投稿郵箱：bjb@chinazwyl.com

Advance in technologies of disease diagnosis based on nucleic acids

PENG Shuang， LI Wei， TIAN Tian， ZHOU Xiang
College of Chemistry and Molecular Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072

Early diagnosis has become more and more important with the elevation of peoples' life， so developing novel technologies and strategies for early diagnosis is urgent and has become the focus in the field of biology and medicine. Especially after the introduction of the concept of “Precision Medicine”， people placed high hopes on the development of more advanced diagnostic technologies. For purpose of this， the chemical biology， probing and regulating living systems with small molecules， has proved to be a potential aspect. Meanwhile， nucleic acids are most important biomacromolecules in vivo， which play key roles in multiple living processes. Thus， studies aimed at nucleic acid associated target are meaningful. Herein， we discuss and summarize the latest progress in technologies for early diagnosis based on nucleic acids， including the technology of SELEX （systematic evolution of ligands by exponential enrichment） detection of epigenetic modifications on nucleic acids and detection of circulating miRNAs.

nucleic acids； diagnosis； aptamer； nucleic acid epigenetic modification； circulating miRNAs； detection

Q599

A

10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.03.05

2015-07-30 ；

2015-08-05

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2012CB720600， 2012CB720603）

彭雙，武漢大學化學與分子科學學院研究生，電子信箱：pengshuang@whu.edu.cn；李娓， 武漢大學化學與分子科學學院研究生，電子信箱：1539565048@qq.com；周翔（通信作者），武漢大學化學與分子科學學院，教授，電子信箱：xzhou@whu.edu.cn；田沺（通信作者），武漢大學化學與分子科學學院，副教授，電子信箱：ttian@whu.edu.cn

引用格式：彭雙，李娓，田沺，等.基于核酸的疾病診斷技術新進展［J］.世界復合醫學，2015，1（3）：212-222