不同濃度的血清素對體外培養大鼠成骨細胞分化的影響

劉海波，孫海飚，韓曉強，盧向東，韓樹峰，王彤

1. 山西醫科大學第一臨床醫學院，太原 030001

2. 山西醫科大學第一醫院 骨科，太原 030001

3. 山西醫科大學公共衛生學院，太原 030001

*論著——老齡與康復醫學*

不同濃度的血清素對體外培養大鼠成骨細胞分化的影響

劉海波1，孫海飚2，韓曉強2，盧向東2，韓樹峰2，王彤3

1. 山西醫科大學第一臨床醫學院，太原 030001

2. 山西醫科大學第一醫院 骨科，太原 030001

3. 山西醫科大學公共衛生學院，太原 030001

目的：研究不同濃度的血清素對體外培養大鼠成骨細胞分化的影響。方法：分離培養新生SD大鼠顱骨的成骨細胞，分別向培養液中加入不同濃度的血清素，分為4組：0 mol/L組（空白對照組）、10-9 mol/L組、10-8 mol/L組、10-7 mol/L組，通過RT-PCR檢測骨鈣素（OCN），堿性磷酸酶（ ALP），Runt相關轉錄因子-2（Runx 2）和Osterix mRNA相對表達量的變化。結果：不同濃度的血清素均可以抑制骨鈣素（OCN），堿性磷酸酶（ ALP），Runt相關轉錄因子-2（Runx 2）和Osterix mRNA的相對表達量，且這種抑制作用隨著血清素濃度的增大而增強。結論：血清素可以劑量依賴性地抑制成骨細胞的分化，這為骨質疏松癥的治療提供了新的思路。

血清素；成骨細胞；分化

骨質疏松癥（Osteoporosis， OP）是一種由各種原因引起的全身性疾病，其特點是骨量減少、骨組織微結構破壞和骨骼脆性增加，從而使人體容易發生骨折［1］。目前研究表明，骨質疏松癥的發生主要與骨代謝的異常有關，即破骨細胞生命周期延長和成骨細胞生命周期縮短導致骨代謝失衡、正常骨量減少［2］。而血清素是一種古老的神經遞質，其化學結構為五-羥色胺（5-TH），廣泛表達于中樞神經系統、周圍神經系統等全身各組織［3］，且有研究表明其可以調節骨形成和骨吸收過程，這對正常骨量的保持顯得尤為重要［4］，可能與骨質疏松癥的發生發展有著密切的關系。目前血清素對體外成骨細胞的影響研究甚少，所以本實驗是研究對原代培養的大鼠成骨細胞施加不同濃度的血清素，并通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測骨鈣素（osteocalcin，OCN），堿性磷酸酶（ alkaline phosphatase， ALP），Runt相關轉錄因子-2（runt-related transcription factor2 ，Runx2）和Osterix 的mRNA相對表達量來探討不同濃度的血清素對體外培養成骨細胞分化的影響，為骨質疏松癥的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

超凈工作臺（BoXun公司，中國）；CO2培養箱（Forma 公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；RNA逆轉率儀及PCR擴增儀（Bio-Rad公司，美國）；DMEM-F12培養液（Hyclone公司，美國）；胎牛血清（杭州四季青，中國）；Trizol試劑（大連Takara 公司，中國）；Primescript RT Master Mix 及PCR擴增試劑（大連Takara 公司，中國）；質量百分比為0.25%的胰蛋白酶、質量百分比為0.1%的Ⅱ型膠原酶、血清素（Sigma公司，美國）；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

1.2 實驗動物

24h內新生SD大鼠（山西醫科大學動物實驗中心），雌雄及體重不限。

1.3 新生大鼠顱骨成骨細胞的分離培養和鑒定

將出生24h以內的SD大鼠斷頸處死，無菌條件下取新生SD大鼠顱骨，用PBS（含100U/ml青霉素 100U/ ml 鏈霉素 ）的培養皿中。加入0.25%胰蛋白酶及0.1%Ⅱ型膠原酶消化后，離心過濾接種于培養瓶中，置于CO2培養箱（37℃，5% CO2）中培養。原代OBs第3天在倒置顯微鏡下拍照觀察，并通過BCI/NBT試劑盒定性檢測ALP，方法為細胞用體積百分比為95%乙醇固定15 min，洗滌3次，加入適量染色工作液室溫避光孵育30 min。

1.4 實驗分組

對體外分離培養的成骨細胞每3 d換液1次，待融合達到約90%時用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。用葡萄糖被覆活性炭處理以去除培養血清中含有的血清素。根據培養基中加入血清素濃度不同將細胞分為4組：0mol/L組（空白對照組）、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組。選取第3代成骨細胞，待其完全貼壁后換成含不同濃度血清素的完全培養基進行培養。

實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測OCN，ALP， Runx2和Osterix mRNA的相對表達量。

在培養的第10天，分別對上述各組成骨細胞加入Trizol試劑提取總RNA，后按37℃反轉錄反應15 min，85℃反轉錄酶的失活反應5s，后4℃1h，逆轉錄得到cDNA。用RT-PCR檢測OCN，ALP，Runx2和Osterix mRNA mRNA的相對表達量（引物序列見表1）。RTPCR的反應條件為：95℃預變性10s；95℃變性5s，退火30s，共40個循環；溶解曲線95℃ 60s，55℃30s，95℃30s，1個循環。以β-actin作為內參來估計初始拷貝數，反應的特異性通過溶解曲線來分析，用2-△△Ct法來計算相關基因的相對表達量。

1.5 統計分析

以上實驗均重復3次，所得的實驗數據采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（± s）表示，組間比較采用單因素方差分析，各組兩兩比較采用SNK法，以p＜0.05表示差異具有統計學意義。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

2.1 成骨細胞形態學觀察及鑒定

倒置顯微鏡下觀察，原代培養第3天的大鼠成骨細胞呈三角形、多邊形、長梭形，胞漿豐富，胞核較圓，輪廓清晰（見圖1）。ALP 定性染色對其進行鑒定，可見成骨細胞胞漿藍染，呈陽性（見圖2）。

圖1 顯微鏡下第三代大鼠成骨細胞形態（100×）

圖2 對大鼠成骨進行ALP免疫組化染色（200×）

2.2 血清素抑制成骨細胞分化

2.2.1血清素抑制成骨細胞OCN和ALP mRNA的相對表達量

ALP和OCN分別是成骨細胞早期分化和晚期的分化標志，本研究結果顯示：空白對照組（0mol/L組）、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組OCN mRNA的相對表達量分別為1.01±0.06、0.79±0.08、0.61±0.05、0.36±0.06，呈劑量依賴性降低，且差異具有統計學意義（P＜0.01）；各組ALP mRNA的相對表達量分別為0.98±0.05、0.76±0.09、0.62±0.07、0.38±0.06，呈劑量依賴性降低，且差異具有統計學意義（P＜0.01）（見表2）。

2.2.2血清素亦能抑制成骨細胞Runx2和Osterix mRNA的相對表達量

Runx2和Osterix是成骨細胞形成的重要轉錄因子，本研究結果顯示：空白對照組（0mol/L組）、10-9mol/ L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組Runx2 mRNA的相對表達量分別為0.99±0.06、0.73±0.06、0.61±0.03、0.46±0.07，呈劑量依賴性降低，且差異具有統計學意義（P＜0.01）；各組Osterix mRNA的相對表達量分別為0.95±0.09、0.80±0.04、0.67±0.04、0.51±0.08，呈劑量依賴性降低，且差異具有統計學意義（P＜0.01（）見表2）。

表2 不同濃度血清素對OCN，ALP，Runx2和Osterix mRNA的相對表達量的影響（2）（n=3， ± s）-△△Ct

3 討論

骨代謝主要包括骨形成和骨吸收，即成過程與破骨過程，這兩個過程的平衡是維持正常骨量的關鍵。而成骨細胞和破骨細胞是骨代謝中成骨過程與破骨過程中的重要功能細胞，其中破骨細胞的作用是骨的吸收。而主要由內外骨膜和骨髓中基質內的間充質干細胞分化而來的成骨細胞，能特異性分泌多種生物活性物質，進而調節并影響骨的形成和重建過程。在不同成熟時期，成骨細胞在體內表現為4種不同形態，即前成骨細胞、成骨細胞、骨細胞和隊形細胞。其中，成骨細胞富含ALP和 OCN，二者分別是成骨細胞早期分化和晚期的分化標志［5］。而Runx2作為成骨細胞分化的重要調節因子［6-8］，在成骨細胞的誘導、復制和成熟的整個過程中發揮著重要的作用，許多影響成骨細胞分化的信號通路和轉錄因子都是通過影響 Runx2 的產生和活化來發揮作用的。另外，Osterix是表達在成骨細胞上的鋅指轉錄因子，在成骨細胞的形成過程中也發揮著重要的作用［9］。研究表明，在Osterix 基因敲除小鼠胚胎中，Ⅰ型膠原、骨鈣素等成骨細胞分化的標志物的表達水平嚴重降低。

血清素作為一種古老的神經遞質其廣泛表達于全身各組織，并且發揮著重要而復雜的生理作用。本研究發現，不同濃度的血清素均可抑制成骨細胞分化的標志物ALP和OCN以及成骨細胞分化的轉錄因子Runx2 和Osterix的表達，且呈劑量依賴性。這與代守前等［5］的研究結果一致，即血清素可以抑制成骨細胞分化，且這可能與血清素激活了不同亞型的血清素受體（如HTlA、5-HTlB、 5-HTlD、5-HT2A、5-HT2B、5-HT2）有關。Yadav等［10］的研究也得出了相似的結論，即血清素可以抑制成骨細胞分化進而抑制骨形成，且這種作用是通過依賴低密度脂蛋白受體相關蛋白-5（low density lipoprotein receptorrelated protein 5，Lrp-5）的途徑實現的。

而有些研究卻得出了相反的結論。Collet 等［11］等構建了敲除5-HT2B受體的基因工程小鼠研究發現，敲除5-HT2B受體基因以后，小鼠的骨密度明顯降低。這說明血清素通過5-HT2B受體可以促進成骨細胞分化，進而促進骨形成。筆者認為，造成這種差異的原因可能是：血清素通過各種不同的信號通路調控成骨細胞的分化，進而促進或者抑制骨的形成。而各實驗研究由于實驗條件、實驗方法及實驗研究側重點等方面的不同導致了在不同研究中不同的信號通路占優，所以會得出不同的結論。

綜上，本研究通過體外培養大鼠顱骨的成骨細胞，并對其施加不同濃度的血清素研究發現，不同濃度的血清素呈劑量依賴性抑制成骨細胞的分化，進而抑制骨的形成，為血清素作為骨質疏松癥治療的新靶點提供了新的依據。在將來隨著對其作用機制的進一步研究和生物科學技術的發展，對血清素的有效調控可能會成為骨質疏松癥的新的方法。

4 結論

血清素可以劑量依賴性地抑制成骨細胞的分化，這為骨質疏松癥的治療提供了新的思路。

（References）

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［5］ 代守前，施秀，韋永中，等.血清素對體外培養大鼠出骨細胞增殖分化和礦化功能的影響［J］.中華創傷骨科雜志，2013，15（9）：784-789.

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［11］ Collet C，Sehihz C，Geoffrey V，et a1.The serotonin 5-HT2B receptor ontrols bone mass via osteoblast recruitment and proliferation［J］.FASEBJ，2008，22（2）：418-427.

The effects of serotonin at different concentrations on differentiation of cultured primary rat osteoblasts in vitro

LIU Haibo1， SUN Haibiao2， HAN Xiaoqiang2， LU Xiangdong2， HAN Shufeng2， WANG Tong3
1. The First Clinical Medical College， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001
2. Department of Orthopedics， the First Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001
3. Department of Public Health， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001

Objective： to study the effects of serotonin at different concentrations on differentiation and of cultured primary rat osteoblasts in vitro. Methods： the osteoblasts from the skull of newborn SD rats， were divied into four groups by the culture medium with different serotonin concentrations： 0mol/L group（blank control）， 10-9mol/L group， 10-8mol/Lgroup and 10-7mol/L group. In addition， mRNA expression of osteocalcin（OCN）， alkaline phosphatase（ALP）， runt-related transcription factor2 （Runx2） and Osterix were quantitated by real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Results： different concentrations of serotonin inhibited the mRNA expression of OCN， ALP， Runx2and Osterix of osteoblasts； And， the inhibitory effect of serotonin was dose-dependent. Conclusion：serotonin can inhibit differentiation of osteoblasts； which provide a novel approach for the treatments of osteoporosis.

serotonin； osteoblasts； differentiation

R681

A

10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.03.07

2015-05-06 ；

2015-07-12

山西省自然科學基金（2013011057-3）

劉海波，碩士研究生，研究方向為血清素對骨質疏松癥影響的基礎研究，電子信箱：86578031@qq.com；韓樹峰（通信作 者），教授，研究方向為骨質疏松和脊柱外科，電子信箱：drhanshufeng@sohu.com；王彤（通信作者），教授，研究方向為多元統計方法，電子信箱：wtstat@21cn.com

引用格式：劉海波，孫海飚，韓曉強，等.基于Hadoop的醫學影像數據平臺應用研究［J］.世界復合醫學，2015，1（3）：227-230