強力枇杷露微生物限度檢查方法的驗證試驗

汪正宇

【摘要】目的：建立強力枇杷露微生物限度檢查的方法驗證。方法：按2010年版《中華人民共和國藥典》，用大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌和白色念珠菌對強力枇杷露微生物限度檢查法進行方法學試驗驗證。結果：強力枇杷露對大腸埃希菌無抑菌作用或抑菌作用較弱。結論：強力枇杷露的細菌、霉菌和酵母菌的計數方法采用常規法，控制菌檢查采用常規法檢驗，該方法用于強力枇杷露的質量控制有效可行。

【關鍵詞】強力枇杷露；微生物限度檢驗法；方法驗證

【中圖分類號】R2841【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）16-0011-02

強力枇杷露是由枇杷葉、罌粟殼、百部、白前、桑白皮、桔梗、薄荷腦等中藥制備的口服復方制劑，具有養陰斂肺，鎮咳祛痰的功效。2010年版《中國藥典》附錄Ⅻ ⅠC微生物限度檢驗方法中規定，藥品的微生物限度檢驗方法必須進行方法驗證，確證供試液制備、測定方法及檢測系統適用于該藥品的檢驗，從而保證微生物限度檢驗方法的科學性和檢驗結果的準確性。本文參照2010年版《中國藥典》、《中國藥品檢驗標準操作規范》進行試驗，建立強力枇杷露的微生物限度檢驗方法并進行方法驗證，結果表明常規法適用于細菌、霉菌及酵母菌計數檢查，控制菌檢查采用常規法。

1儀器與材料

11試驗環境根據2010年版《中國藥典》規定，試驗在環境潔凈度10000級，局部潔凈度100級的單向流空氣的無菌室進行，陽性菌操作在符合國家Ⅱ級生物安全標準的生物安全柜內進行。

1.2實驗儀器BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州蘇凈儀器自控設備有限公司）；GHP-9162型電熱恒溫培養箱（上海金慧科電子有限公司）；MJX-160B-Z型微電腦霉菌培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；DYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海市博訊實業有限公司醫療設備廠）；TZQ-Ⅱ型勻質器型號（天津市津德實驗儀器技術開發中心）。

1.3供試品強力枇杷露（批號：20140609、20140610、20140611，安徽省雪楓藥業有限公司）。

1.4驗證菌種大腸埃希菌[Escherichia coli，CMCC（B） 44 102]、枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis，CMCC（B） 63 501]、金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B） 26 003]、白色念珠菌[Candida albicans，CMCC（F） 98 001]由中國醫學菌種保藏中心提供；黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F） 98 003]由中國藥品生物制品檢定所提供。試驗用菌株的傳代次數為3代。

1.5培養基營養瓊脂培養基（批號：121130）、玫瑰紅鈉瓊培養基（批號：110811）、營養肉湯培養基（批號：110406）、改良馬丁培養基（批號：130227）、曙紅亞甲藍瓊脂培養氧基（EMB，批號：1110102）、膽鹽乳糖培養基（批號：1111162）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG，批號：1110102）均由北京三藥科技開發公司提供。

2方法與結果

2.1菌懸液的制備黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌置營養肉湯液體培養基中培養（培養條件為33℃培養24小時），各取上述培養物1ml，用09%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋法稀釋至10-5、10-6、10-7，備用；白色念珠菌置改良馬丁液體培養基中培養（培養條件為25℃培養24小時），取上述培養物1ml，用09%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋法稀釋至10-5、10-6、10-7，備用；黑曲霉置改良馬丁液體培養基中培養（培養條件為25℃培養1周），取上述培養物5ml，用09%無菌氯化鈉溶液洗脫黑曲霉孢子，吸取孢子菌懸液（經無菌棉花過濾）1ml，用10倍稀釋法稀釋至10-6，備用。

2.2菌懸液中含菌量檢驗取“2.1”中枯草芽孢桿菌10-5級稀釋液1ml放入已滅菌的培養皿中，用45℃無菌營養瓊脂培養基20ml注培養皿，且平行測定兩皿，33℃培養48h后計數；取10-7級金黃色葡萄球菌、10-7級大腸埃希菌分別注培養皿培養，方法及培養條件同枯草芽孢桿菌。取“2.1”中白色念珠菌10-5級稀釋液和10-6級黑曲霉孢子菌懸液各1ml放入已滅菌的培養皿中，用低于45℃玫瑰紅鈉瓊脂培養基20ml注培養皿，25℃培養5d，逐日觀察計數。

根據2010年版《中國藥典》規定，細菌、霉菌和酵母菌方法驗證所用菌懸液含菌量應為50～100 cfu/ml；控制菌方法驗證所用菌懸液含菌量為10～100 cfu/ml。結果見表1，符合要求。

2.3供試液制備取本品最小包裝兩瓶，按微生物限度檢查法規定稱取10g，加pH70的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，即為1∶10的供試品溶液。

2.4細菌、霉菌和酵母菌計數方法驗證（平皿法）

2.41試驗組取1∶10供試液1ml和金黃色葡萄球菌10-7級菌懸液1ml，注入同一無菌培養皿中，立即傾注低于45℃營養瓊脂培養基約20ml，待凝固后置于33℃陽性細菌培養箱中倒置培養24～72h，逐日觀察結果并記錄。枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的驗證同金黃色葡萄球菌的實驗方法。取1∶10供試液1ml，白色念珠菌10-5級菌懸液1ml，注入無菌培養皿，立即傾注45℃無菌玫瑰紅鈉培養基20ml，待凝固后置于25℃陽性霉菌培養箱中倒置培養5d，逐日觀察結果并記錄。黑曲霉的驗證同白色念珠菌的實驗方法。

2.42菌液組取金黃色葡萄球菌10-7級、枯草芽孢桿菌10-5級和大腸埃希菌10-7級菌懸液各1ml，分別注入培養皿中，立即傾注低于45℃營養瓊脂培養基，待培養基凝固后，置33℃細菌陽性培養箱中培養24～72h，逐日觀察結果并記錄。取白色念珠菌10-5級和黑曲霉10-6級菌懸液各1ml，分別注入平皿，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后置25℃霉菌陽性培養箱中培養5天，逐日觀察結果并記錄。

2.43供試品對照組取1∶10供試液1ml，注入平皿，立即傾注低于45℃無菌營養瓊脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待培養基凝固后，將營養瓊脂培養基置于33℃培養24～72h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基置25℃培養5d，逐日觀察結果并記錄。

2.4 4試驗結果由表2可知，3次平行試驗大腸埃細菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的試驗組回收率均均大于70%，根據2010年版《中國藥典》的要求可以確定常規法作為檢查方法。

2.5控制菌（大腸埃希菌）檢查方法驗證（常規法）

2.51試驗組取已滅菌的裝有100ml膽鹽乳糖培養基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入1：10供試液10ml，10-7級大腸埃希菌菌懸液10ml，放置于35℃陽性培養箱中培養24h，按大腸埃細菌的檢查法檢查。

2.52供試品組取1：10供試液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養基中，放置于培養箱（35℃）中培養24h，按大腸埃細菌的檢查法檢查。

2.53陽性對照組取規定量的大腸埃希菌加入到100ml無菌膽鹽乳糖培養基中，放置于陽性培養箱（35℃）中培養24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.54陰性對照組取稀釋液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養基中，放置于培養箱（35℃）中培養24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.55陰性菌對照組陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌，方法同試驗組。

2.56實驗結果由表3可知，大腸埃希菌陽性組、試驗組生長良好，說明強力枇杷露對大腸埃希菌無抑菌作用或抑菌作用較弱，可以采用常規法檢查。

3討論

由上述驗證結果可知，可以采用常規法對細菌、霉菌及酵母菌進行檢查；控制菌大腸埃希菌可采用常規法檢驗。

由于方法驗證中陽性菌會造成環境污染，所以必須嚴格按照2010年版《中國藥典》附錄中方法驗證的規定，在陽性室的生物安全柜內操作，做好防護措施。同時供試品組及陰性對照組應在符合規定的潔凈室內操作。

方法驗證需進行三次平行實驗，為使結果獲得良好的重現性，所加的培養基體積應盡量一致，培養基與所加試液應充分混合均勻。

菌落計數是方法驗證實驗過程中極為重要的一步，因此計數時應仔觀察，必要時可借助放大鏡等工具，排除藥渣和小氣泡的干擾，減少操作誤差。

參考文獻

[1] 南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].上海：上海科學技術出版社，2006：833-853.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：107-116.

[3] 中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范[S]. 北京：中國醫藥科技出版社.2010：351-369.

（收稿日期：20150508）