星點設計-效應面法優化四物湯中揮發油包合工藝

楊歡，何瑤，劉婷婷，傅超美，周莉江

實驗室 四川省中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

《四物湯》出自于唐朝藺道人所著《仙授理傷續斷秘方》。全方由熟地黃、當歸、白芍、川芎組成，具有補血和血的功效，主治營血虛滯癥[1]。本方是補血常用方，也是調經的基本方。因其常用于婦科疾病，故稱譽為“婦科圣方”。目前國內已有四物合劑、四物片、四物膠囊、四物顆粒作為中成藥品種上市銷售。在四物湯系列制劑中：四物合劑、四物片、四物膠囊、四物顆粒制法項下均規定，當歸、川芎須先經水蒸氣蒸餾以充分獲取所含有的揮發性成分。同時，藥理研究表明，四物湯中揮發油具有抗炎、鎮痛、雙向調節子宮平滑肌等作用[2~3]，為四物湯中的重要活性成分[4]。四物湯中揮發油主要成分為藁本內酯，但藁本內酯性質極不穩定[5~6]。近年來，β-環糊精包合技術廣泛用于固體制劑中揮發油的包合，可增強揮發油對光熱的穩定性，具有矯臭矯味，提高生物利用度，使液體藥物固體化[7]等優點。本文先采用正交設計法對揮發油提取工藝進行篩選，再利用星點設計優化揮發油包合工藝，從而較好提取四物湯中的揮發油，并有效提高揮發油的穩定性。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑

熟地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.干燥塊根的炮制加工品（太極集團四川綿陽制藥有限公司，批號：1311007）。當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels.的干燥根（太極集團四川綿陽制藥有限公司，批號：1311008）。川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖的炮制加工品（四川浩博藥業有限公司，批號：131201）。白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根（太極集團四川綿陽制藥有限公司，批號：1312006）。以上中藥飲片，經檢驗符合《中國藥典》(2010年版)標準。β-環糊精（成都市科龍化工試劑廠，批號：20120813）。

1.2 實驗儀器

揮發油提取器（北京西苑玻璃儀器公司），DZG- 6020 型真空干燥箱( 上海森信實驗儀器有限公司)，HH-SJ集熱式恒溫磁力攪拌器（金壇市城東新瑞儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 揮發油提取工藝研究

根據預試驗結果，取四物湯中當歸、川芎飲片（或粉末）各50 g，浸泡30 min，采用水蒸氣蒸餾法提取四物湯中的揮發油。按照L9(34) 正交設計法，以當歸、川芎粉末粒度（A）、加水量(B)、提取時間(C)為主要影響因素，以揮發油得率為評價指標，對揮發油的提取工藝進行篩選，因素水平見表1，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。實驗結果表明：對四物湯揮發油提取的影響由大到小為：粉末粒度>提取時間>加水量。由方差分析可知：四物湯揮發油的提取過程中，粉末粒度對提取率具有極顯著影響（p<0. 01），提取時間具有顯著影響（p<0. 05），正交試驗篩選的揮發油提取工藝為：A3B3C2，即取當歸、川芎飲片粉碎成中粉，加入8倍量的水，水蒸氣蒸餾提取5 h。按照以上工藝進行三批次驗證實驗，實驗結果（見表4）表明該工藝揮發油得率穩定，其收率為0.89%。

表1 揮發油提取因素水平表

表2 揮發油提取L9(34)正交試驗結果表

表3 方差分析表

表4 正交實驗工藝驗證結果

2.2 星點試驗設計優化四物湯揮發油包合工藝

2.2.1 星點試驗設計 采用β-環糊精包合方法中的飽和水溶液法，以β-環糊精(g) :揮發油(mL)比例、包合溫度（℃）及包合時間(min)為自變量，以揮發油利用率（%）、包合物收得率（%）總評歸一值OD為因變量，每個因素設 5 水平，用代碼－α、－1、0、+1、+α來表示，因素水平見表5，星點設計及結果見表6。

揮發油的利用率和收得率是衡量包合效果的重要指標，利用率(反映質量)越高，收得率(反映產量)越高，包合效果越好。

揮發油利用率Y1%=包合物揮發油量 /（揮發油加入量×空白回收率）×100%

包合物收得率Y2%=包合物重量/（β-環糊精重量+揮發油重量）×100%

表5 星點設計因素水平表

2.2.2 空白回收試驗 精密量取當歸-川芎揮發油l mL，加無水乙醇1.5 mL使溶解，置500 mL燒瓶中，加蒸餾水100 mL和沸石數粒，連接揮發油提取器，按照《中國藥典》2010版附錄XD項下，揮發油測定法提取揮發油，至油量不再增加時停止加熱(約5小時)，放置1 h，讀取揮發油量。計算空白回收率，測得回收率為91%。

2.2.3 試驗設計及結果 β-環糊精包合物的制備方法：本文選用飽和水溶液法進行包合。各試驗號按星點設計因素水平表要求在設計溫度下配制β-環糊精飽和水溶液，加入揮發油l mL進行包合實驗。包合完畢后，置冰箱冷藏，抽濾，減壓干燥，即得白色粉末狀包合物。四物湯揮發油包合工藝試驗設計及結果見表6

表6 四物湯揮發油包合工藝試驗設計及結果

17 0 0 0 70.4 79.86 0.784664 18 0 0 0 71.38 81.4 0.811439 19 0 0 0 71.87 80.62 0.808042 20 0 0 0 71.49 80.48 0.80262

2.2.4 總評歸一值（OD）的計算 將表6中揮發油利用率（Y1）、包合物收得率（Y2）數值標準化為0-1間的歸一值,并將歸一值求算幾何平均數，得總評歸一值（Overall Desirability，OD）。OD=(d1×d2×.….×dn)1/n，n為指標數，本實驗的指標數為2。揮發油利用率（Y1）、包合物收得率（Y2）取值均為越大越好。對取值越大越好的效應采用Hassan方法分別進行數學轉換求“歸一值”dmax。

2.2.5 模型擬合 以OD值為因變量對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合，使用Design-Expert8.0軟件擬合模型。

多元線性回歸方程為：

二項式擬合方程為：

方差分析見表7，結果顯示該模型具有高度的顯著性，方差的可信度及擬合度均較好，故可用此模型對揮發油包合工藝進行預測和分析。

表7 四物湯揮發油包合工藝方差分析

2.2.6 工藝優化與預測 采用Design-Expert8.0軟件對包合工藝進行優化和預測。結果表明最優工藝為：β-環糊精(g) :揮發油(ml) = 9.80:1，包合溫度為40℃，包合時間110 min，預測OD值為0.9882。效應面圖及等高線圖見圖1到圖6。

圖1 環糊精比例和包合溫度對OD值的效應面圖

圖2 環糊精比例和包合溫度OD值的等高線圖

圖3 環糊精比例和包合時間對OD值的效應面圖

圖4 環糊精比例和包合時間對OD值的等高線圖

圖5 包合溫度和包合時間對OD值的效應面圖

圖6 包合溫度和包合時間對OD值的等高線圖

2.2.7 驗證試驗 根據效應面優化的最佳工藝進行三批工藝驗證實驗，制備四物湯揮發油β-環糊精包合物，其利用率為81.17%，收得率為87.4%（見表8）。結果表明，二項式擬合方程預測值與實測值的偏差為1.13 %，[偏差= (預測值-實測值) /預測值×100% ] ，說明二項式擬合效果良好，可信度高。

表8 最佳工藝驗證結果

3 討論

四物湯中的揮發油是四物湯的一個重要活性部位，特別是其主要成分藁本內酯具有調經、鎮痛、抗炎、解熱等藥理作用，但藁本內酯化學性質不穩定[8~9]。為了充分發揮四物湯制劑中揮發油的療效，本研究將其用β-環糊精包合，不僅可以保留揮發油的生理活性，而且能掩蓋揮發油的氣味，提高制劑的生物利用度，便于制劑成型，更重要的是可以提高揮發油的穩定性。星點設計-效應面優化法具有精密度高、預測值接近真實值等優點[10]。本研究通過正交試驗優選出四物湯揮發油提取工藝，再利用星點試驗設計優化得到四物湯揮發油最佳包合工藝。經驗證，優化后的工藝參數能較好提取四物湯中的揮發油，并使β-環糊精包合揮發油后的揮發油利用率、包合物收得率較高。該工藝穩定可行，能有效提高四物湯制劑中揮發油穩定性，為后期四物湯系列制劑制備工藝優化及新制劑研發提供參考和依據。

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