溶劑法提取藕節中鞣質的工藝優化

文 洋，譚 君，譚 斌，劉仲華，何長征

（1. 湖南農業大學園藝園林學院， 湖南 長沙410128； 2. 湖南農業大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心， 湖南 長沙410000）

我國是蓮藕的原產地之一，蓮藕資源非常豐富。藕節是指去除須根的蓮的干燥根莖節部，無氣味，味甘、澀，有較好的凝血、止血及散瘀功效[1-4]。目前，市場上對止血藥的需求量很大，除了手術必備以外，日常生活中的磕碰損傷也經常用到此藥。而對于那些長期患有血液病的病人更加意義重大，如再生障礙性貧血等，這類患者長期食用藕節湯，能較好地改善病情，有益于疾病的緩解及身體的康復。

研究發現，藕節的止血功效主要與其富含鞣質有關[5-6]。藕節中的鞣質在具備收斂、止血、促凝血[7-8]功效的同時，還有較強的抗氧化作用[9]；也兼具鞣質類物質共同的藥理活性，如抑菌、抗病毒、抗腫瘤、護肝益腎等活性[10]。通常，將藕節加工成藕節炭，其止血活性部位的主要成分為3-表白樺脂酸[11-14]。

目前，國內外對于藕節的研究主要集中在其止血特性以及藕節炭的成分測定等方面[15-16]，也有針對藕節中活性成分的提制工藝[17-22]和檢測方法[23-25]的相關研究。筆者在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗設計對藕節中鞣質的溶劑提取工藝進行優化，利用磷鉬鎢酸比色法對提取的鞣質進行檢測，以確定藕節中鞣質的最佳提取工藝參數，為藕節中鞣質的工業化生產利用打下基礎；同時，試驗是以日常廢棄的藕節為材料提取生物活性物質，實現了廢棄物的再利用，創造了較大的經濟和社會效益。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要儀器設備 FZ-102 微型植物粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司），Lab Tech 可見- 紫外分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司），SK3300LH 超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司），RE-52AA 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠），HH 數顯恒溫水浴鍋（金壇市金城國勝實驗儀器廠），電子分析天平（SHIMADZU、AUW 220D），實驗室常見的玻璃儀器。

1.1.2 主要試劑 沒食子酸標準品（純度為98%，成都曼斯特生物科技有限公司），食用乙醇、甲醇（分析純，青島凱祥化工有限公司），鎢酸鈉、磷鎢酸（分析純，成都科龍化學試劑廠），無水碳酸鈉（分析純，重慶北培精細化工廠），鹽酸（分析純，天津凱諾化工有限公司），溴水、磷酸（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 磷鉬鎢酸試劑的配制 取鎢酸鈉100 g、鉬酸鈉25 g，加水700 m L 使其溶解，加100 m L 鹽酸、250 m L 磷酸，加熱回流10 h，放冷，再加150 g 硫酸鋰、50 m L 水和0.2 m L 溴水，煮沸除去殘留的溴（約15 min），冷卻，加水稀釋至1 000 m L，過濾即得。

1.2.2 供試樣制備 將新鮮藕節粉碎，準確稱取10.0 g 于500 m L 帶塞錐形瓶中，在不同工藝下進行提取，待提取液冷卻后，抽濾至100 m L 容量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置，即為提取樣品。

1.2.3 鞣質含量的檢測 吸取2.0 m L 提取樣品置于25 m L 容量瓶中，加磷鉬鎢酸試劑1.0 m L，加水10 m L，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應的空白試劑做參比，在λmax處測定吸光度值，根據標準曲線的線性方程計算鞣質的含量。

式中：k，表示提取樣品的稀釋倍數；C，表示鞣質濃度（mg/m L）；V，表示提取樣品定容后的溶液體積（m L）；W，表示稱取的新鮮藕節的質量（mg）。

1.2.4 最大吸收波長的確定 將沒食子酸標準品0.5 g 放入棕色容量瓶中，定容至100 m L，再從其中取5 m L 溶液至于50 m L 容量瓶中定容，制得濃度為0.5 mg/m L 的標準儲備溶液。精密吸取2.0 m L 標準儲備溶液（0.5 mg/m L），置25 m L 棕色量瓶中，加1.0 m L磷鉬鎢酸試液、10 m L 水，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 m in，以空白試劑做參比，在400～900 nm 波長范圍內繪制吸收曲線，根據最大吸收峰來確定最大吸收波長。

1.2.5 標準曲線的繪制 參考中國藥典2005 版中鞣質含量的測定方法，將沒食子酸作為檢測藕節中鞣質含量的對照品。分別準確移取1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 m L標準儲備溶液（0.5 mg/m L）置于25 m L 棕色容量瓶中，各加磷鉬鎢酸試液1.0 m L，再分別加10.5、9.0、7.5、6.0、4.5 m L 水，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，得濃度依次為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mg/m L 的沒食子酸標準使用溶液，搖勻，放置30 m in，以空白試劑做參比，在最大吸收波長處測定吸光度，以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 單因素試驗 （1）料液比。精確稱取10.00 g 經處理的藕節樣品，分別加入80%的乙醇溶液20、50、80、110、140 m L（即料液比1︰2、1︰5、1︰8、1︰11、1︰14），置于40℃搖床震蕩提取2.5 h，抽濾；重復1次；濾液合并于250 m L 容量瓶中定容（1︰14 料液比處理的提取液定容至500 m L），搖勻，再依次從中吸取1.0 m L 提取液稀釋至10 m L（定容500 m L 的提取液不稀釋），按照1.2.3 的步驟進行檢測。（2）乙醇濃度。精確稱取10.00 g 經處理后的藕節樣品，分別用35%、50%、65%、80%、95%的乙醇溶液進行提取，料液比為1︰11，提取時間為2.5 h，溫度為40℃；重復1次；將兩次提取的溶液合并，抽濾定容同上，按照1.2.3的步驟進行檢測。（3）提取溫度。精確稱取10.00 g 經處理后的藕節樣品，用80%的乙醇溶液分別在30、40、50、60℃溫度下提取，料液比為1︰11，提取時間為2.5 h；重復1 次；合并兩次的提取液，抽濾定容同上，按照1.2.3 的步驟進行檢測。（4）提取時間。精確稱取10.00 g 經處理后的藕節樣品，用80%的乙醇溶液（料液比為1︰11）在50℃下分別提取1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h；重復1 次；合并兩次的提取液，抽濾定容同上，按照1.2.3 的步驟進行檢測。（5）提取次數。精確稱取10.00 g 經處理后的藕節樣品，用80%的乙醇溶液在40℃下提取，料液比為1︰11，提取時間為2.5 h；分別提取1、2、3、4 次，合并各次的提取液，抽濾定容同上，按照1.2.3 的步驟進行檢測。

1.2.7 正交試驗 通過單因素試驗明確正交試驗的4個考察因素為：A 料液比、B 乙醇濃度、C 提取溫度和D 提取時間；各因素的最佳水平范圍依次為：料液比1∶8～1∶11、乙醇濃度70%～90%、提取溫度50℃附近、提取時間4.5 h 左右。在此基礎上進行L9（34）的正交試驗設計，其因素水平見表1。各組試驗均提取3次，合并提取液抽濾后，稀釋10 倍的提取液按1.2.3的步驟進行檢測。

表1 L9（34）的因素水平

1.2.8 最佳工藝的驗證 分別稱取10.00g 藕節樣品5 份，按照正交試驗獲得的最佳工藝參數進行提取，稀釋后測定鞣質的得率，以驗證最佳工藝的準確性和重復性。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長

由400～900 nm 波長范圍內的吸收曲線可知，沒食子酸標準品的最大吸收波長（λmax）為760 nm，與中國藥典2005 版鞣質含量的測定方法中沒食子酸的λmax=754 nm 有稍許出入，考慮到760 nm 和754 nm 處沒食子酸的吸光度值相差很小，根據實驗事實確定沒食子酸的λmax為760 nm，并以此作為藕節中鞣質的檢測波長。

2.2 標準曲線

由圖1 可知，該標準曲線在0.03～0.15 mg/m L 的范圍內具有良好的線性關系，其線性系數R 達到0.998 7（R2=0.997 4），符合測定要求。

圖1 沒食子酸標準品的標準曲線

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 料液比 從圖2a 中可以看出，料液比為1︰8和1︰11 的處理，鞣質的得率較高，但當料液比為1︰14 時，鞣質的得率反而降低了，可能是因為藕節中的鞣質降解了（鞣質的得率是占10 g 新鮮藕節的百分比，因而不存在因為溶劑量加大而產生稀釋作用。鞣質本身屬于結構復雜的酚類化合物，在空氣中易于氧化，或者水解）。而根據圖中趨勢可知，在1︰8 和1︰11 的料液比之間應存在曲線的最高點，故在正交試驗設計中將該因素的水平范圍定為1︰8～1︰11 之間。

2.3.2 乙醇濃度 由圖2 b 可以看出，在乙醇濃度為35%～80%范圍內時，鞣質的得率隨著乙醇濃度的增加而升高，但當乙醇濃度高于80%時，鞣質的得率隨著乙醇濃度的增加而降低，故在正交試驗中，選擇70%～90%的乙醇濃度作為該因素的考察范圍。

2.3.3 提取溫度 由圖2 c 可知，隨著提取溫度的升高，得率逐漸升高，當提取溫度達50℃時，得率升高的趨勢趨于平緩，50℃與60℃下的得率未見明顯差別。而有關資料表明，在鞣質的提取過程中，溫度過高會使鞣質分解為其他物質，這些物質在760 nm 波長處仍有較大吸收峰，從而干擾試驗結果。因此，正交試驗中設計的提取溫度范圍為40～50℃。

2.3.4 提取時間 由圖2 d 可知，隨著提取時間的延長，藕節中鞣質的得率表現出先增加后下降的趨勢；在提取4.5 h 時，藕節中鞣質的得率最高。這可能是由于藕節中的鞣質不穩定，提取時間過長，藕節中的鞣質被降解了。因此，在設計正交試驗中，提取時間范圍設置為4.0～5.0 h。

2.3.5 提取次數 不同提取次數的測定結果顯示，僅提取1 次時，藕節中的鞣質提取不夠充分，得率僅為0.86%；提取2 次時，得率增加為1.17%；提取3 次時，得率增加至1.33%；提取4 次時，得率沒有明顯的改善，為1.35%。從經濟實惠、生態環保的角度考慮，選擇3 次為最佳提取次數。

圖2 不同提取條件下藕節中鞣質的得率

2.4 正交試驗結果

由表2 可知，采用乙醇提取藕節中的鞣質最佳工藝參數為A2B2C3D1（試驗5），即料液比1︰10、乙醇濃度80%、提取溫度50℃、提取時間4.0 h，得率為1.289 4%。由極差值可知，各因素對提取效果影響的大小順序為：料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間，即料液比為最主要的影響因素，乙醇濃度次之，其中提取時間對藕節中鞣質的得率影響較小。由表3 的方差分析結果可知，料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間對試驗結果的影響均沒有極顯著性意義。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗結果的方差分析

2.5 最佳工藝驗證

按正交試驗得出的最佳工藝對藕節中的鞣質進行重復提取，鞣質的得率分別為1.320 4%、1.299 0%、1.283 8%、1.390 4%、1.180 6%，重復間的相對標準偏差（RSD）為5.85%，從而證實該方法精密度高、重復性好，具有良好的穩定性。

3 結論與討論

生產上鞣質的高效提取需要綜合考慮安全、成本和環保3個方面的因素，而乙醇作為食品工業常用的有機溶劑，廉價易得，提取效果顯著，相對安全，易于揮發脫除，便于回收循環利用，故研究中選取乙醇作為提取溶劑中的有機相，結合水的配比對藕節進行萃取，分別考察料液比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度和提取次數等單因素對得率的影響。

正交試驗的因素增加1個，其不同因素和水平組合的試驗次數將顯著增加。例如：4 因素3 水平的正交設計需要做9 次試驗L9（34），而5 因素4 水平的正交設計需要做16 次試驗L16（45），工作量顯著增加。而從單因素試驗結果來看，提取次數與其他的各因素之間沒有明顯的交互關系，故確定提取次數為3 次后，對其他4個因素進行3 水平的正交試驗設計，以確定藕節中鞣質的最佳提取工藝參數。

該研究在利用磷鉬鎢酸/干酪素法測定藕節中鞣質含量的基礎上，通過單因素試驗和正交試驗從料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間、提取次數等方面對藕節中鞣質類物質的乙醇提取工藝進行了優化。結果表明，在料液比1︰10、乙醇濃度80%、提取溫度50℃、提取時間4.0 h 的條件下，藕節中鞣質的得率平均可達1.294 8%，最高得率可達1.390 4%。同時，該工藝操作簡單方便，成本較低，適合工業化生產，為藕節中鞣質類化合物的進一步開發利用奠定了基礎。

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