利用qPCR技術檢測柑橘潰瘍病菌的靈敏度分析

李文娟，肖 翠，戴素明，李大志，鄧子牛

（湖南農業大學園藝園林學院，國家柑橘改良中心長沙分中心，湖南 長沙410128）

柑橘潰瘍病（Citrus bacterial canker disease，CBCD）是由柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodis pv.citri，Xac）引起的一種世界性檢疫病害，嚴重危害柑橘產業的發展[1]。對于非疫區要嚴格禁止攜帶潰瘍病菌的柑橘材料流入，加強對柑橘潰瘍病菌的檢測。目前，常用的柑橘潰瘍病菌檢測方法有典型癥狀目測法、組織病理切片法、病原分離物致病性檢測、噬菌體檢測法、酶聯免疫吸附法（ELISA）和斑點免疫結合法（DIA）等，但這些方法普遍存在檢測周期長、特異性不強、靈敏度不高的局限性，不能很好地滿足檢驗檢疫工作的要求[2]。相比傳統檢測方法，常規PCR 檢測技術更快速、更準確。王中康等[3]根據柑橘潰瘍病菌全基因組中獨有的保守蛋白質基因序列，設計篩選出一對特異性引物（JYF5/R5），能將柑橘潰瘍病菌與非致病性黃單胞菌、野油菜黃單胞菌等近緣種進行區分，且d在健康柑橘樣品中不能擴增出條帶。

實時熒光定量PCR （Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是對常規PCR 進行改進的新型核酸定量技術，具有實時、精確、靈敏等特點。研究表明，采用實時熒光定量PCR 建立的柑橘潰瘍病菌檢測體系，特異性強，靈敏度比常規PCR 技術高2～3個數量級[4]。

湖南省是我國重要的柑橘生產基地，其主栽品種冰糖橙常年遭受柑橘潰瘍病危害，急需建立快速準確的冰糖橙潰瘍病菌檢測方法。研究以常規PCR 為對照，分析qPCR 檢測柑橘潰瘍病菌DNA 和柑橘潰瘍病菌菌量的靈敏度；同時，應用該方法對接種柑橘潰瘍病菌后的冰糖橙樣品進行動態監測，以期為實現冰糖橙潰瘍病菌早期檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

無病毒冰糖橙植株、柑橘潰瘍病菌種均由國家柑橘改良中心長沙分中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液制備 挑取28℃劃線培養48 h 的柑橘潰瘍病菌單菌落至LB 液體培養基中，于28℃下200 rpm 振蕩培養20 h；室溫下以8 000 rpm 離心5 m in 收集菌體；用無菌水重懸菌體，并調整OD600≈0.6 后用系列稀釋法確定菌懸液濃度。

1.2.2 病原菌接種 將不同濃度的潰瘍病菌液接種于冰糖橙葉片上，以無菌水作對照，接種量為5 μL。取樣以接種點為中心用6 mm 打孔器打取圓片，每個處理打取圓片10 片，重復3 次，用于后續DNA 提取和潰瘍病菌檢測。

1.2.3 基因組DNA 的提取 采用細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取柑橘潰瘍病菌DNA，步驟參照說明書。冰糖橙DNA 的提取采用CTAB 法，步驟參考高志明等[5]的方法。

1.2.4 qPCR 反應程序 反應混合液體系：SYBR Green SuperM ix（Bio-Rad）10 μL，上游引物1 μL（10 μM），下游引物1 μL（10 μM）（引物參照趙云等[2]Xac F06/R06 引物對），反應總體積為20 μL。反應程序：95℃預變性5 m in；95℃變性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸20 s，進行40個循環；72℃延伸3 min，16℃保存。

1.2.5 常規PCR 反應程序 反應混合液體系：10×Buffer（含Mg2+）2 μL，Taq DNA 聚合酶（全式金公司）0.2 μL（5 u/μL），dNTPs（全式金公司）1 μL（10 mM），上游引物1 μL（10 μM），下游引物1 μL（10 μM）（引物參照趙云等[2]Xac F06/R06 引物對），反應總體積為20 μL。反應程序：95℃預變性5 m in；95℃變性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸20 s，進行35個循環；72℃延伸3 min，16℃保存。

2 結果與分析

2.1 PCR 檢測柑橘潰瘍病菌DNA 的靈敏度分析

以未感病冰糖橙葉片DNA 為對照，用qPCR 和常規PCR 對純柑橘潰瘍病菌DNA 和混有植物DNA的柑橘潰瘍病菌DNA 進行檢測。從圖1 中可以看出，常規PCR 檢測純潰瘍病菌DNA 的質量下限為2×10-4ng，其中DNA 質量在200～2×10-3ng 范圍內常規PCR擴增條帶亮度明顯，DNA 質量為2×10-4ng 時條帶亮度微弱，DNA 質量為2×10-5ng 及以下數量級時，沒有條帶。

從圖2 中可以看出，當柑橘潰瘍病菌DNA 混有植物DNA 時，常規PCR 檢測下限為2×10-3ng，其中DNA 質量在200～2×10-2ng 范圍內常規PCR 擴增條帶亮度明顯，DNA 質量為2×10-3ng 時條帶亮度微弱，DNA 質量為2×10-4ng 及以下數量級時，沒有條帶。由此可見，植物DNA 會影響常規PCR 擴增效果，使其檢測靈敏度下降1個數量級。

圖1 Xac DNA 常規PCR 檢測電泳圖

圖2 Xac DNA 與植物DNA 混合后常規PCR 檢測電泳圖

從表1 中可以看出，對于純柑橘潰瘍病菌DNA，試驗所配置的所有數量級qPCR 都能檢測到，而常規PCR 檢測不到2×10-5ng 及以下數量級；同樣，對于混有植物DNA 的柑橘潰瘍病菌DNA，所有數量級qPCR 都能檢測到，而常規PCR 檢測不到2×10-4ng 及以下數量級。此外，對于混有或不混有植物DNA 的樣品，qPCR 檢測的結果較為相似，由此可知，植物DNA對qPCR 檢測影響不顯著。

2.2 PCR 檢測柑橘潰瘍病菌量的靈敏度分析

用常規PCR 和qPCR 對不同濃度柑橘潰瘍病菌液進行檢測，結果見圖3 和表2。由圖3 可知，常規PCR 檢測柑橘潰瘍病菌菌量下限為40 cfu，其中菌量在4×106～4×102cfu 范圍內常規PCR 擴增條帶亮度明顯，菌量為40 cfu 時條帶亮度微弱，菌量為4 cfu 時沒有條帶。而由表2 可知，qPCR 所有數量級都能檢測到，常規PCR 檢測不到的4 cfu 也能檢測到。

用qPCR 和常規PCR 對接種不同菌量的冰糖橙樣品DNA 進行檢測，結果見圖4 和表3。從圖4 中可以看出，常規PCR 檢測柑橘潰瘍病菌接菌量下限為1.5×104cfu，其中接菌量在1.5×107～1.5×105cfu 范圍內常規PCR 擴增條帶亮度明顯，接菌量為1.5×104cfu時條帶亮度微弱，接菌量在1.5×103cfu 及以下數量級時沒有條帶。而從表3 中可以看出，qPCR 所有數量級都能檢測到，常規PCR 檢測不到的1.5×103cfu 及以下數量級也能檢測到。

表1 不同DNA 模板qPCR 檢測結果

圖3 不同菌量的常規PCR 檢測電泳圖

表2 不同菌量的qPCR 檢測結果

2.3 利用PCR 對冰糖橙接種后進行動態監測

圖4 接菌量不同的冰糖橙樣品的常規PCR 檢測

表3 接菌量不同的冰糖橙樣品的qPCR 檢測

通過觀察，接菌量為5×103cfu 的冰糖橙在第9 天開始出現潰瘍病典型病斑。分別用常規PCR 和qPCR 對接種后不同天數材料進行取樣分析，結果見圖5 和圖6。由圖5 可知，常規PCR 僅能在接種后第2 天的樣品中檢測出柑橘潰瘍病菌，且條帶非常微弱；隨著接種后的時間延長，常規PCR 擴增條帶的亮度逐漸增強。而由圖6 可知，qPCR 在接種后立刻就能在植物樣品中檢測出柑橘潰瘍病菌。隨著時間推移Cq 值減小，說明接種后潰瘍病菌在逐漸增殖，其中接種后1～3 d增殖緩慢，第4 天開始增殖迅速。

圖5 接種潰瘍病菌后冰糖橙樣品的常規PCR 檢測

圖6 接種潰瘍病菌后冰糖橙的qPCR 檢測

3 討論

柑橘潰瘍病是柑橘類作物的主要病害，建立快速準確的診斷鑒定體系是柑橘種植地區病情監測以及柑橘苗木、果品出入境檢驗檢疫服務的迫切需求[6]。試驗通過常規PCR 對柑橘潰瘍病菌DNA 和柑橘潰瘍病菌進行檢測，結果顯示其檢測靈敏度比qPCR 低1～3個數量級，且植物DNA 會影響常規PCR 對潰瘍病菌DNA 的檢測，使其檢測靈敏度下降1個數量級，而qPCR 不受植物DNA 的影響。

相關研究表明，基于PCR 的檢測方法，柑橘材料制樣會影響PCR 擴增，田間病害防治大量施用的多種銅制劑中Cu2+殘存于柑橘葉面，會抑制PCR 擴增，制樣時柑橘組織外滲的色素、多元酚以及氯原酸[7]等物質也會抑制PCR 擴增，這些物質的抑制作用可能導致檢測的假陰性，從而影響病害診斷與病原鑒定。

柑橘潰瘍病菌感染柑橘時有一定的潛伏期，在潛伏期內柑橘植株不表現感病癥狀，采用傳統的檢測方法難以檢測出帶菌但不顯癥的柑橘材料，因此難以避免這類材料流入非疫區。目前，針對柑橘潰瘍病菌的分子檢測多是利用常規PCR 和實時熒光定量PCR 等方法[8]。2012年，Bruno D 等[9]利用實時熒光定量PCR對Venturia spp. 在蘋果葉片上的動態生長進行監控。這表明也可以利用實時熒光定量PCR 來監控柑橘材料上潰瘍病菌的增殖。研究利用qPCR 和常規PCR 對接種后冰糖橙樣品進行分析，qPCR 即時就能檢測到柑橘潰瘍病菌，并能觀察到潰瘍病菌先慢后快的增殖趨勢，而常規PCR 要接種后2 d 才能檢測到柑橘潰瘍病菌，且擴增條帶很微弱。由此可見，qPCR 適用于柑橘無癥帶菌材料的早期檢測，這將為qPCR 應用于冰糖橙潰瘍病菌檢測提供參考，也將為利用qPCR 實現冰糖橙潰瘍病菌早期檢測提供依據。

[1]劉 鵬，易圖永，安 然，等.湖南省柑橘潰瘍病病菌生理生化特性初步研究[J].中國植保導刊，2009，29（6）：5-8.

[2]趙 云.柑橘潰瘍病的定量PCR檢驗檢疫技術研究[D].重慶：重慶大學，2006.

[3]王中康，孫憲昀，夏玉先，等.柑橘潰瘍病菌PCR快速檢驗檢疫技術研究[J].植物病理學報，2004，31（1）：14-20.

[4]殷幼平，黃冠軍，趙 云，等.柑橘潰瘍病菌實時熒光定量PCR檢測與應用[J].植物保護學報，2007，34（6）：607-613.

[5]高志明，范少輝，彭鎮華，等.基于CTAB法提取毛竹基因組DNA的探討[J].林業科學研究，2006，19（6）：725-728.

[6]Tim S S，Shabbir A R，Sun X A，et al.Meeting the challenge of eradicating citrus canker in Florida-Again[J].Plant Disease，2001，85：340-356.

[7]Singh R P，Singh M，King R R.Use of citric acid for neutralizing polymerase chain reaction inhibition by chlorogenic acid in potato extracts[J].JournalofVirologicalMehtods，1998，（74）：231-235.

[8]陳小帆，莫 瑾，左 靜，等.利用雙重PCR技術檢測柑橘潰瘍病菌[J].華南農業大學學報，2010，31（3）：32-35.

[9]Bruno D，Anke D L，Rozemarijn D，etal.Real-time PCR asa promising tool tomonitorgrowth ofVenturiaspp.in scab-susceptibleand resistant apple leaves[J].European Journal of Plant Pathology，2012，134：821-833.