芹菜素對丙烯腈引起大鼠精子脂質過氧化和DNA損傷的影響

陳軍義，趙乾龍，張潔，常銳霞，趙曉非，黨瑜慧，李芝蘭

蘭州大學公共衛生學院，蘭州 730000

芹菜素對丙烯腈引起大鼠精子脂質過氧化和DNA損傷的影響

陳軍義，趙乾龍，張潔，常銳霞，趙曉非，黨瑜慧，李芝蘭*

蘭州大學公共衛生學院，蘭州 730000

分析芹菜素(apigenin, AP)對丙烯腈(acrylonitrile, ACN)引起的大鼠精子脂質過氧化和DNA損傷的影響，并探討其可能的機制。將50只SPF級SD成年雄性大鼠隨機分為陰性對照組(玉米油)、ACN組(50 mg·kg-1ACN)、低AP組(50 mg·kg-1ACN+234 mg·kg-1AP)、高AP組(50 mg·kg-1ACN+468 mg·kg-1AP)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)組(50 mg·kg-1ACN+300 mg·kg-1NAC)，以5 mL·(kg bw)-1灌胃染毒，1次·d-1，6 d·周-1，連續13周。檢測大鼠精子活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及精子DNA損傷情況。結果發現，ACN組、低AP組、高AP組、NAC組精子ROS、MDA含量顯著升高，SOD活力顯著降低，精子尾部DNA含量百分比、尾長、尾距、Olive尾距均顯著增高于對照組(均P < 0.05)；而低AP組、高AP組、NAC組精子ROS、MDA含量、SOD活性和精子DNA損傷情況與ACN組相比差異均無統計學意義(P > 0.05)。提示ACN可引起大鼠精子脂質過氧化和DNA損傷，而AP、NAC對其無干預作用。

芹菜素；丙烯腈；精子；大鼠；脂質過氧化；DNA損傷；彗星實驗

芹菜素(apigenin, AP)為一種具有廣泛生物學作用的黃酮類化合物，存在于蔬菜、水果、豆類和茶葉等中，其中芹菜中含量最高。其化學結構為4’,5,7-三羥基黃酮，特殊的結構決定了其抗氧化、抗腫瘤、降壓、鎮靜等多種生物學作用。AP抗氧化作用的結構基礎首先是4’、5、7位置的羥基可以結合自由基，其次是5、7位的羥基可以絡合金屬離子，且7位羥基具有很強的酸性，同時2、3位的雙鍵起到穩定作用[1]。AP的抗氧化作用機制可能表現為對超氧陰離子及脂質過氧化物的清除，與鐵和銅等金屬離子螯合，抑制NO的生成，抑制細胞核內DNA的氧化損傷等方面[2-5]。有研究報道AP可顯著降低雄性大鼠肝主要的抗氧化酶活性，234、468、936 mg·kg-1的AP在不同的臟器中可表現為促氧化/抗氧化作用，可能是在不同細胞內的代謝方式影響了其生物學作用[6-8]，其中234、468 mg·kg-1的AP對大鼠睪丸組織中表現為抗氧化作用。

丙烯腈(acrylonitrile, ACN)又稱乙烯基氰，是一種廣泛應用于合成腈綸纖維、丁腈橡膠、合成樹脂等的有機合成單體，也可用于食品包裝及醫用材料如高滲透性滲析管、義肢、胰島移植膜等，是重要的環境污染物之一。目前，除職業性接觸以外一般人群通過生活用品的潛在接觸越來越引起關注。ACN毒性作用廣泛，急性毒性主要表現為非特異性的中樞神經系統、胃腸道、腎上腺等癥狀，嚴重者可因呼吸衰竭而死亡；其作用機制主要表現為以下3個方面：一是代謝過程中產生的CN-直接作用于機體所致，二是ACN與組織蛋白結合而損傷其功能，三是組織中谷胱甘肽(GSH)的耗竭使組織受到脂質過氧化的損傷[9]。流行病學研究顯示，ACN慢性接觸可表現為頭暈、頭痛、失眠等神經系統癥狀，也可引起心率、血壓、脈壓等的升高，；接觸組中眼病、嘔吐及皮膚干燥的發生率也明顯增高[10-11]。除一般毒性外，動物實驗研究表明ACN具有潛在的致癌性，實驗組大鼠腦癌、肺癌、胃癌的發生率顯著增高[12]，但流行病學資料顯示ACN接觸工人肺癌、腦腫瘤、前列腺癌發生率的升高無統計學意義，膀胱癌的發生率升高與ACN接觸史無關[13]。由于缺乏強有力的證據，1999年國際癌癥研究機構(IARC)將ACN的致癌性由2A降為2B類。目前，ACN的生殖毒性也引起了人們的關注。動物實驗研究表明，ACN具有雄性生殖毒性[14]，可引起動物睪丸脂質過氧酶活性的改變，打破氧化還原反應平衡，也可導致睪丸支持細胞、間質細胞損傷，改變生精細胞DNA含量及細胞周期[15]，導致精子畸形率的升高[16]，對小鼠精細胞DNA產生交聯和斷裂作用[17]。同時ACN可引起接觸男工精子DNA鏈的斷裂和性染色體非整倍體[18]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)是一種抗氧化劑，對多種物質引起的氧化損傷和DNA損傷具有保護作用。因此本實驗通過分析NAC和AP對ACN引起雄性大鼠精子脂質過氧化的影響，研究AP的抗氧化作用，為AP的開發利用提供參考依據。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1實驗對象

SPF級成年健康雄性SD大鼠50只，體重250～300 g，由甘肅中醫學院醫學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(甘)2011-0001。大鼠飼養于甘肅中醫學院醫學動物實驗中心，實驗室合格證號：SYXK(甘)2011-0001，大鼠自由飲水進食。

1.2主要試劑及儀器

ACN(分析純，純度>99%)購于天津四通化工廠；AP(純度98.23%)，購于陜西慧科植物有限公司；NAC(純度≥99.9%)，購于美國Amresco公司?；钚匝?ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。主要儀器：流式細胞儀(美國Becton，Dichinson and Company公司，型號LSRFortessa)；離心機(美國Beckman coulter公司，型號Microfuge 22R Centrifuge)；723N分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；酶標儀(美國BioTek公司，型號EONC)；電泳儀(美國Bio-Rad公司，型號Power Basic)；JA3003N電子秤(上海精密科學儀器有限公司)；DK-600S型三用恒溫水浴箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.3實驗方法

大鼠適應性飼養1周后，按體重隨機分為5組，每組10只：陰性對照組(玉米油)、ACN組(50 mg·kg-1ACN)、低AP組(50 mg·kg-1ACN+234 mg·kg-1AP)、高AP組(50 mg·kg-1ACN+468 mg·kg-1AP)、NAC組(50 mg·kg-1ACN+300 mg·kg-1NAC)。ACN和AP用玉米油配制成所需劑量，NAC用生理鹽水配置成所需劑量，按5 mL·kg-1灌胃量灌胃染毒，1次·d-1，6 d·周-1，連續染毒13周；每隔3 d稱重調整灌胃量。聯合染毒組先分別灌胃AP、NAC，30 min后灌胃ACN。于灌胃后30 min內觀察大鼠行為變化。末次染毒24 h后稱量體重，每組隨機選取6只大鼠用頸椎脫臼法處死，摘取左側附睪，放入盛有3 mL的37 ℃的PBS液的離心管中，用眼科剪剪碎附睪，37 ℃水浴15 min讓精子游出，200目尼龍篩網過濾制備精子懸液。

1.4精子MDA、SOD檢測

調整精子濃度為106·mL-1的精子懸液，按試劑盒說明書進行。

1.5精子ROS檢測

調整精子懸液精子濃度為106·mL-1，將490 μL精子懸液加入1:499(V:V)稀釋的DCFH-DA熒光分子探針10 μL中，37 ℃孵育40 min，PBS液沖洗2次(2 000 r·min-1，4 min，4 ℃)，流式細胞術檢測其熒光強度(激發波長488 nm，發射波長526 nm)，每個樣本檢測10 000個細胞，分析其ROS水平。

1.6精子單細胞凝膠電泳

首先將35 μL正常熔點瓊脂糖溶液均勻鋪于用體積分數為95%的乙醇浸泡過夜的磨砂載玻片并放置在4 ℃共10 min。然后在已鋪好的底膠上加50 μL精子單細胞懸浮液，并迅速加100 μL低熔點瓊脂糖溶液，混勻并迅速蓋上蓋玻片，4 ℃冷凝10 min。取掉蓋玻片，加入裂解液后在4 ℃裂解1 h。裂解結束后浸于4 ℃去離子水中，4 ℃冰箱中靜置5 min，將玻片轉移至電泳槽中，緩緩注入4 ℃預冷的電泳緩沖液，液面沒過玻片表面5 mm左右解旋20 min。在電流300 mA條件下避光電泳20 min后移至中和液中至沒過玻片，4 ℃中和15 min，然后用5 μg·mL-1的碘化丙啶(PI)避光染色20 min。去離子水脫色15 min后熒光顯微鏡觀察，綠光激發，觀察倍數目鏡10×，物鏡40×，拍照保存。

1.7精子單細胞凝膠電泳圖像分析

用彗星圖像分析軟件CASP(comet assay software project)對精子單細胞凝膠電泳圖像進行分析，每個劑量組分析200個精子細胞。用尾部DNA含量百分比(tail DNA100%)、尾長(tail length)、尾距(tail moment)、Olive尾距(Olive tail moment)作為衡量精子DNA損傷的指標。

1.8統計學方法

2　結果(Results)

2.1AP對ACN引起大鼠行為及體重的影響

染毒前各劑量組大鼠體重差異無統計學意義(P > 0.05)，染毒過程中各劑量組大鼠體重增長趨勢大致相同，但各時間點體重差異均無統計學意義(P > 0.05)，見圖1。

實驗過程中未出現大鼠死亡，ACN組大鼠從染毒第6周后出現流涎、躁動、易激惹等行為表現，其他各組均未見明顯異常。

圖1　染毒期間各劑量組大鼠體重變化情況 注：ACN、AP、NAC表示丙烯腈、芹菜素、N-乙酰半胱氨酸。Fig. 1　The weight changes of rats in all dosage groups during the period of exposure Note: ACN, AP, NAC stand for acrylonitrile, apigenin, and N-acetylcysteine.

2.2ACN對大鼠精子ROS、SOD、MDA的影響

由表1可知，ACN組大鼠精子ROS、MDA水平均顯著升高，與對照組相比差異有統計學意義(P < 0.05)；ACN組大鼠精子SOD低于對照組，差異有統計學意義(P < 0.05)。

組別GroupROS/MFI#MDA/(nmol·mg-1prot)SOD/(U·mg-1prot)對照組Control454.33±260.327.65±2.1273.34±16.49ACN組ACN50mg·kg-11458.33±366.83*11.07±2.92*46.87±6.20*低AP組AP234mg·kg-11351.23±192.81*10.36±3.61*47.72±4.84*高AP組AP468mg·kg-11330.33±525.94*11.27±1.44*47.21±9.73*NAC組NAC300mg·kg-11371.67±565.06*10.11±2.14*54.48±5.30*

注：對照組相比，*P < 0.05；#MFI，平均熒光強度。

Note: Compared with control,*P < 0.05;#MFI, means fluorescence intensity.

2.3AP對ACN引起大鼠精子ROS、SOD、MDA改變的影響

由表1可見，低AP組、高AP組和NAC組大鼠精子ROS水平明顯升高，與對照組相比差異有統計學意義(P < 0.05)。低AP組、高AP組和NAC組大鼠精子SOD均明顯低于對照組，差異有統計學意義(P < 0.05)，但低AP組、高AP組和NAC組大鼠精子SOD與ACN組相比差異無統計學意義(P > 0.05)。精子MDA含量在低AP組、高AP組和NAC組均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P < 0.05)，但低AP組、高AP組和NAC組大鼠精子SOD與ACN組相比差異無統計學意義(P > 0.05)。低AP組、高AP組和NAC組大鼠精子ROS、MDA、SOD水平與ACN組相比差異均無統計學意義(P > 0.05)。

2.4AP對ACN引起大鼠精子DNA損傷的影響

如表2所示，ACN可導致大鼠精子彗星尾部DNA百分比含量、尾長、尾距、Olive尾距均增高，與對照組相比差異均有統計學意義(P < 0.05或P < 0.01)。低AP組、高AP組和NAC組大鼠精子彗星尾部DNA百分比含量、尾長、尾距、Olive尾距均增高，與對照組相比差異均有統計學意義(P < 0.05或P < 0.01)，但與ACN組相比差異無統計學意義(P > 0.05)。

3　討論(Discussion)

ROS是一類氧的代謝產物及其衍生物，其化學性質比氧更為活潑，主要包括超氧陰離子(·O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)等。精子ROS的產生主要有3種方式：①精子質膜NADPH(還原型輔酶II)-氧化酶體系；②線粒體NADH(還原型輔酶I)依賴的氧化還原酶體系；③12-肉豆蔻酸鹽-13-乙酸鹽-phorbol酯(PMA)誘導精子生成ROS[19]。其中線粒體途徑是精子ROS生成的主要途徑。生理情況下，適量的ROS對維持精子正常的功能具有重要的意義，但精子缺乏胞質抗氧化酶系統，因此過量的ROS會對精子產生重要的影響，主要表現為精子質膜、精子線粒體和精子DNA的損傷。過量的ROS對精子質膜的影響主要表現為通過引發精子膜上的

組別Group尾部DNA含量/%TailDNA%尾長/μmTaillength/μm尾距TailmomentOlive尾距Olivetailmoment對照組Control1.58±0.185.96±0.710.36±0.060.81±0.12ACN組ACN50mg·kg-14.10±0.86*13.88±2.62**1.42±0.58*2.15±0.38**低AP組AP234mg·kg-13.58±0.67*11.27±1.86**1.21±0.23*1.71±0.23**高AP組AP468mg·kg-13.83±1.01*11.30±2.21**1.26±0.37*1.78±0.36**NAC組NAC300mg·kg-13.20±0.98*12.17±0.79**1.02±0.38*1.94±0.37**

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note: Compard with control, *P < 0.05， **P < 0.01.

多聚不飽和脂肪酸的過氧化反應產生大量脂類過氧化物。MDA是不飽和脂肪酸代謝終產物之一，其生成量可間接反應精子膜的脂類過氧化程度。SOD是細胞中重要的抗氧化酶之一，在機體清除氧自由基的過程中起著關鍵作用。ROS可以直接攻擊SOD生成過氧化氫，而高濃度的過氧化氫會破壞SOD的結構，使酶活性下降。

ACN能抑制抗氧化酶活性使機體抗氧化系統下降從而引起氧化應激，而ROS的增加是其可能的氧化應激機制[20]。ACN可引起大鼠睪丸組織SOD活性降低、MDA含量的增加。AP能夠直接清除自由基，螯合過渡態金屬離子Fe2+、Cu2+等以及抑制一氧化氮(NO)的生成，從而降低·OH的合成，最終使MDA的生成減少[2]。NAC是半胱氨酸的衍生物，是谷胱甘肽的前體，能合成具有生物活性的谷胱甘肽，具有抗氧化和清除自由基的作用[21]。有研究顯示，15 nmol·L-1的NAC可顯著提高5 ℃液態保存24 h后雞精子活力、精子直線運動速度、曲線運動速度、平均路徑速度等精子運動參數[22]。同時，給先天性不育癥患者口服600 mg·d-1的NAC可顯著提高精子總抗氧化能力[23]。因此本研究以NAC作為陽性對照，研究AP的抗氧化作用。結果顯示，ACN組、低AP組、高AP組和NAC組大鼠精子ROS水平顯著高于對照組，SOD活力顯著降低，MDA含量顯著升高。提示ACN可影響大鼠精子氧化還原平衡體系，而低AP組、高AP組和NAC組大鼠精子ROS水平、SOD活力與ACN組相比差異無統計學意義，提示在本實驗條件下，300 mg·kg-1的NAC未能影響ACN造成的大鼠精子氧化損傷，而Esmat等[24]學者發現5.0 mmol·L-1的NAC對干預ACN引起的大鼠主神經膠質細胞的氧化損傷具有重要的作用，但Carrera 等[25]研究顯示20 nmol·L-1的NAC不能抵抗ACN引起的大鼠神經膠質細胞的氧化損傷。本研究結果顯示，234、468 mg·kg-1劑量的AP對50 mg·kg-1的ACN造成的大鼠精子氧化還原平衡的影響也沒有干預作用。因此，在本實驗條件下，NAC、AP均不能對ACN引起的大鼠精子ROS的產生、SOD活性的降低產生影響，未顯示其抗氧化功效。

單細胞凝膠電泳技術(single cell gel eletrophoresis, SCGE)是一種快速檢測單細胞DNA完整性的實驗技術，因其細胞電泳形態似彗星，又稱彗星實驗(comet assay)。ACN進入體內可與DNA烷化共價結合，且其釋放的CN-促進了ACN的毒性作用，同時由于氧自由基過多和抗氧化酶的平衡失調導致ROS過多，會造成精子DNA單鏈和雙鏈的斷裂[26-28]。本研究結果顯示，ACN組大鼠精子彗星尾部DNA百分含量、尾長、尾距、Olive尾距均高于對照組，提示在本實驗條件下ACN同樣造成了大鼠精子DNA的損傷?？寡趸瘎㎞AC對多種物質引起的DNA損傷具有一定的保護作用。趙珺等[29]體外實驗研究發現低劑量的AP能有效清除·OH及其所引發的DNA損傷程度，或延遲其受損時間。實驗結果因此表明AP對·OH有清除作用，從而能抑制·OH對DNA的氧化損傷。本實驗結果顯示，低AP組、高AP組、NAC組大鼠精子彗星尾部DNA百分含量、尾長、尾距、Olive尾距與ACN組相比差異均無統計學意義，提示在本實驗條件下，未發現234、468 mg·kg-1AP和300 mg·kg-1NAC對ACN引起的大鼠精子DNA損傷有干預作用。

綜上所述，在本實驗條件下，50 mg·kg-1ACN可造成大鼠精子氧化還原平衡的破壞，精子ROS、MDA含量升高、SOD活性降低，且可引起大鼠精子DNA的損傷。234、468 mg·kg-1AP和300 mg·kg-1NAC對ACN引起的大鼠精子氧化損傷、DNA損傷無保護作用。

致謝：感謝蘭州大學公共衛生學院王曉霞副教授在文章修改中給予的幫助。

通訊作者簡介：李芝蘭(1962-)，女，碩士研究生導師，教授，蘭州大學公共衛生學院兒少衛生與婦幼保健學研究所所長，研究方向為婦女勞動衛生與生殖健康。

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Effect of Apigenin on Acrylontrile-Induced Lipid Peroxidation and DNA Damage in Sperm of Male Rats

Chen Junyi, Zhao Qianlong, Zhang Jie, Chang Ruixia, Zhao Xiaofei, Dang Yuhui, Li Zhilan*

School of Public Health, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

1 June 2015accepted 28 July 2015

In this study, the effect of apigenin (AP) on acrylontrile-(ACN) induced lipid peroxidation and DNA damage of sperm in male rats were examined and the possible mechanisms were discussed. 50 healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups: control group (corn oil), ACN group (50 mg·kg-1ACN), low-dose AP group (50 mg·kg-1ACN+234 mg·kg-1AP), high-dose AP group (50 mg·kg-1ACN+468 mg·kg-1AP) and NAC group (50 mg·kg-1ACN+300 mg·kg-1NAC). The rats were intragastrically administered daily with 5 mL·kg-1(boby weight) for 13 weeks, 6 days per week. The sperm samples were collected for the determination of the content of reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA), the activity of superoxide dismutase (SOD), and the DNA damage. The result showed in comparison with control group, the contents of ROS and MDA, the tail DNA%, tail length, tail moment and Olive tail moment were increased significantly in ACN group, low-dose AP group, high-dose AP group and NAC group, while the activity of SOD was decreased significantly in these groups (P < 0.05). In contrast, the difference among low-dose AP group, high-dose AP group, NAC group and ACN group had no statistical significance (P > 0.05). These data indicate that regardless the presence of AP and/or NAC, ACN could induce sperm lipid peroxidation and DNA damage in male rats.

apigenin; acrylontrile; rat; sperm; lipid peroxidation; DNA damage; comet assay

中央高?；究蒲袠I務專項資金項目(lzujbky-2014-221)

陳軍義(1987-)，男，碩士，研究方向為婦女勞動衛生與生殖健康，E-mail: chenjy2013@lzu.edu.cn

Corresponding author)， E-mail: lizhl@lzu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150601003

2015-06-01 錄用日期：2015-07-28

1673-5897(2015)6-166-07

R114

A

陳軍義，趙乾龍，張潔, 等. 芹菜素對丙烯腈引起大鼠精子脂質過氧化和DNA損傷的影響[J]. 生態毒理學報，2015, 10(6): 166-172

Chen J Y, Zhao Q L, Zhang J, et al. Effect of apigenin on acrylontrile-induced lipid peroxidation and DNA damage in sperm of male rats [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 166-172 (in Chinese)