黑土微生物量和酶活性對鄰苯二甲酸二丁酯污染的響應

王志剛，趙曉松，徐偉慧，蘇云鵬，由義敏，劉帥，胡影，胡云龍，張穎

1. 齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，齊齊哈爾 161006 2. 東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030

黑土微生物量和酶活性對鄰苯二甲酸二丁酯污染的響應

王志剛1，趙曉松1，徐偉慧1，蘇云鵬1，由義敏1，劉帥1，胡影1，胡云龍1，張穎2,*

1. 齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，齊齊哈爾 161006 2. 東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030

鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate, DBP)是一種在環境中廣泛存在的有毒有機化合物，已被我國列為優先控制污染物之一。本研究探討了不同濃度的DBP污染對黑土呼吸、微生物量以及黑土酶活性的影響。結果表明，DBP污染處理的黑土呼吸速率和微生物量碳較對照均顯著增加；微生物氮在DBP污染過程中呈“降低-升高-降低”波動性變化；微生物磷與DBP污染濃度呈顯著負相關；DBP對黑土多酚氧化酶表現為先促進后抑制，對轉化酶和蛋白酶活性表現為低濃度促進而高濃度抑制；在DBP污染過程中脲酶呈現被激活狀態；黑土過氧化氫酶和酸性磷酸酶均受到DBP污染的顯著抑制。通過相關性分析發現，土壤微生物量、土壤酶活性與DBP污染濃度之間存在著高度的相關性。由此可推斷，DBP污染改變了黑土呼吸、微生物量和酶學活性的代謝特征，進而有可能影響了黑土的生態系統功能，威脅到黑土的可持續利用。

鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)；土壤呼吸；微生物量；土壤酶；黑土；污染

鄰苯二甲酸酯(phthalate esters, PAEs)是一類人工合成的有機化合物[1]，主要用于塑料產品的成型劑。目前，PAEs已經成為全球最為普遍的工業化合有機污染物之一，其中鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate, DBP)在土壤、地表水、沉積物、淡水生物、植物和蔬菜中被廣泛檢出[2]，也因其具有潛在的環境危害[3-4]，中國環境檢測中心和美國環境保護局已經將DBP列為優先控制污染物[5]。

東北黑土是世界上僅有的三大黑土區之一，在保障我國糧食安全方面具有不可替代的作用[6]。DBP可以通過塑料薄膜、灌溉和農藥等方式進入土壤環境[7]，在東北黑土中DBP含量在2.8～14.6 mg·kg-1[8]，遠遠超過美國環境保護局制定的0.08 mg·kg-1土壤凈化標準[9]，但是其在黑土中的行為特征及其規律尚不明確，因此，研究DBP污染對黑土微生物生物量和酶活性的影響，對于闡釋DBP的環境行為和黑土資源保護具有重要意義。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1試驗地點與實驗土壤制備

本試驗始于2014年9月30日，在東北農業大學園藝站(哈爾濱市)的溫室中進行。供試土壤取自哈爾濱香坊農場(45°41′N, 126°45′E)的大豆田，為表層土壤(0～20 cm)，在土壤中未檢測到DBP殘留。土壤被充分混均后，過2 mm篩，去除植物殘體和石塊。土壤基本性質如表1所示。

1.2實驗設計

DBP(純度>99.9%)購于中國標準物質標準樣品信息中心，助溶劑為丙酮，制備成1 000 mg·L-1的DBP儲備液，于4 ℃冰箱內避光保存備用。

每個樣品稱取650 g土壤置于1 L(12.2 cm × 12 cm)花盆中，調整實驗土壤濕度到田間最大持水量的80%，在25 ℃的黑暗培養箱中預培養7 d后，用DBP儲備液調整土壤DBP濃度，共計5個處理，分別為對照(CK)，0 mg·kg-1；DBP1處理，5 mg·kg-1；DBP2處理，10 mg·kg-1；DBP3處理，20 mg·kg-1；DBP4處理，40 mg·kg-1。對照處理(CK)添加等量丙酮進行處理。每個處理5次重復，置于培養箱內培養。在實驗期間，用恒重法保持土壤含水量30%，溫度為(25±2) ℃，培養箱內相對濕度為70%±5%。于不同時間取樣測定土壤中的微生物學各項指標。

1.3土壤微生物呼吸速率與生物量的測定

土壤微生物呼吸速率采用堿液吸收滴定法測定，用每小時呼出的CO2量表示(mg (CO2)·kg-1·h-1)[10]。土壤微生物量碳采用氯仿熏蒸0.5 mol·L-1K2SO4溶液浸提，重鉻酸鉀氧化法測定；微生物量氮采用氯仿熏蒸0.5 mol·L-1K2SO4溶液浸提，茚三酮比色法測定；微生物量磷采用氯仿熏蒸NaHCO3提取，鉬銻抗比色法測定[11-12]。

表1　試驗黑土的基本性質

注：USDA代表美國農業部。

Note: USDA stands for U.S. Department of Agriculture; TOC stands for total organic carbon; CEC stands for cation exchange capacity; TN stands for total nitrogen; TP stands for total phosphorus.

1.4土壤酶活性的測定

脲酶活性測定用苯酚-次氯酸鈉比色法，以37 ℃、24 h后，1 g土壤生成的NH3-N質量(μg)表征，表示為μg·g-1·h-1(以NH3-N計)；土壤過氧化氫酶活性的測定采用KMnO4滴定法，結果以20 min后1 g土壤消耗0.05 mol·L-1KMnO4的毫升數來表示；多酚氧化酶采用鄰苯三酚比色法；土壤轉化酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定；蛋白酶活性測定用酪蛋白酸鈉分析方法，以50 ℃、2 h后，5 g土壤生成的酪氨酸質量(μg)表征，表示為μg·g-1·h-1(以酪氨酸計)；酸性磷酸酶活性以24小時每克土壤中釋放出酚的毫克數表征[13-14]。為了消除土壤和試劑的誤差，每一土樣均設無基質和無土壤對照，3次重復。

1.5數據統計分析方法

數據用SPSS 17.0軟件進行統計分析，采用Sigma Plot 12.5作圖。

2　結果與分析(Results and analysis)

2.1黑土微生物呼吸速率對DBP污染的響應

土壤呼吸是衡量土壤微生物活性或評價土壤肥力的重要指標，通過圖1可知，DBP污染處理10 d內，4個污染濃度處理的黑土呼吸速率均顯著(P<0.05)高于對照(CK)，在處理7 d后增幅逐漸減少，且在10 d內各濃度處理間的呼吸速率呈現顯著差異。

2.2黑土微生物量對DBP污染的響應

黑土微生物碳、氮和磷在DBP污染過程中呈現了不同的變化規律(圖2)。微生物碳在DBP污染5 d后，與對照相比，表現為低濃度(5和10 mg·kg-1)促進，高濃度(20和40 mg·kg-1)抑制；10 d后各個濃度處理均表現為促進效應，但是低濃度DBP處理強于高濃度的促進效應，20 d后促進效應逐漸減弱(圖2a)。微生物氮在DBP污染過程中呈“降低-升高-降低”波動性變化(圖2b)，在5 d時，微生物氮與DBP污染濃度呈顯著負相關(r2=0.75**)，處理10 d后各處理均呈現相似的波動變化，但是并未發現與DBP污染濃度之間的相關性。微生物磷受到DBP污染的抑制(圖2c)，且微生物磷與DBP污染濃度呈顯著負相關(r2=0.63**)，在15 d后這種抑制效應有逐漸恢復的趨勢。

圖1　黑土微生物呼吸速率對鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)污染的響應Fig. 1　Response of black soil respiratory rate to di-n-butyl phthalate (DBP) contamination

圖2　黑土微生物量對DBP污染的響應Fig. 2　Response of microbial biomass in black soil to DBP contamination

2.3黑土酶活性對DBP污染的響應

黑土酶活性在DBP污染過程中的動態變化結果見圖3。在處理5 d時，DBP對黑土多酚氧化酶有促進作用，且低濃度(5和10 mg·kg-1)處理的促進效應顯著強于高濃度(20和40 mg·kg-1)處理，10 d后呈現為抑制效應，且有隨著污染濃度提升而增強的趨勢(圖3a)。轉化酶活性在低濃度DBP(5和10 mg·kg-1)條件下表現為促進效應，而高濃度DBP(20和40 mg·kg-1)條件下表現為先抑制后促進(圖3b)。在DBP污染過程中脲酶呈現激活效應，隨著培養時間的增加激活效應逐漸增強，但在15 d后激活效應有減弱的趨勢，且激活效應與DBP濃度正相關(r2=0.78)(圖3c)；黑土過氧化氫酶和酸性磷酸酶均受到DBP污染的顯著抑制(P<0.05)，且抑制程度與DBP處理濃度均呈顯著相關(r2=0.85和r2=0.79)(圖3d, e)。在處理25 d內，低濃度DBP(5、10和20 mg·kg-1)處理對黑土蛋白酶有促進作用，且差異極其顯著(P<0.01)，而高濃度DBP(40 mg·kg-1)處理中，黑土蛋白酶活性顯著高于對照(P<0.01)(圖3f)。

2.4土壤微生物量與酶活性的相關性分析

將黑土培養25 d時的生物量(碳、氮、磷)、土壤酶活性和DBP起始濃度進行Pearson雙尾相關性分析，結果如表2所示。微生物碳含量與蛋白酶活性呈顯著負相關，與轉化酶活性呈顯著正相關；微生物氮與酸性磷酸酶活性呈顯著正相關；過氧化氫酶與微生物磷和酸性磷酸酶活性呈顯著正相關，與脲酶和蛋白酶活性呈顯著負相關；DBP污染濃度與脲酶活性呈顯著正相關，與酸性磷酸酶和過氧化氫酶呈顯著負相關。因此，土壤微生物量、土壤酶活性與DBP污染濃度之間存在相關性，有著緊密聯系。

圖3　黑土酶活性對DBP污染的響應Fig. 3　Effects of DBP contamination on enzyme activities in black soil

3　討論(Discussion)

微生物在土壤生態系統中參與一切有機物質的分解和轉化，且對土壤生態環境的變化極為敏感，可以反映土壤質量的變化和人類活動的干擾[15]。土壤呼吸速率可作為土壤生物活性和土壤肥力乃至透氣性的指標，并且指示著土壤生態系統演替的過程與方向[16]。

本研究結果表明，DBP污染導致土壤基礎呼吸被激活，且激活作用隨培養時間的延長而減弱，這一結果與郭楊等(2010)[17]在水稻土中和高軍等(2008)[18]在黃棕壤中的研究結果相一致。原因可能是PAEs可作為某些土壤微生物的碳源和能源，利用這些底物時表現出較高的代謝活性，土壤呼吸速率升高；但隨著培養時間的延長其生物有效性降低，土壤呼吸下降。鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)對黑土呼吸具有低濃度促進高濃度抑制的效應[16]，與DBP對黑土呼吸的影響不一致，可能是因為分子量(DMP和DBP分子量分別為194.19和278.34)和水分配系數(DMP和DBP的lgKow分別為1.60和3.74)不同所引起的[19]。土壤微生物量是土壤有機質和土壤養分轉化與循環的動力，可作為土壤中有效養分的儲備庫[20]。本研究結果表明，DBP污染顯著增加黑土微生物碳含量，這一現象與王鑫宏[21]在吉林軟土上的研究結果相似，也與微生物呼吸速率增加的結果相互印證；微生物氮呈現波動降低的現象以及微生物磷受到DBP污染的顯著抑制，說明DBP污染導致了黑土養分庫的改變，這可能是酞酸酯污染導致了黑土微生物的功能代謝菌群的改變所致[22]。污染物進入到土壤中會引起土壤中各微生物種群活細胞數量及組成結構的變化，導致土壤中的微生物在生理代謝方面做出響應[23]，最終影響到土壤酶活性。本研究發現，在DBP污染過程中，脲酶、蛋白酶、轉化酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶和多酚氧化酶的活力均不同程度的受到了影響，與張建等 (2010)[24]和Gao等(2010)[25]在其他類型土壤上的研究結果不盡一致，這可能與土壤類型的不同有關系。過氧化氫酶、多酚氧化酶和轉換酶活性可以反映出土壤有機碳素的轉化速率，蛋白酶和脲酶可以反映土壤中有效氮素的代謝水平，磷酸酶可以反應土壤磷素代謝轉化速率[26-27]。通過相關性分析發現，土壤微生物量、土壤酶活性和DBP污染濃度三者之間存在相關性，且脲酶、酸性磷酸酶和過氧化氫酶與DBP污染相關性更強，這一結果與Eivazi等[28]和Frankenberger等[29]的研究結果相一致。因此，我們可以推斷DBP污染影響了黑土中碳氮磷元素的轉化循環，從而有可能影響黑土生態系統功能。

表2　DBP污染過程中土壤微生物量與土壤酶活性的相關性分析

注：*在0.05水平(雙側)上顯著相關，**在0.01水平(雙側)上顯著相關。

Note:*P<0.05, ** P<0.01.

本研究發現黑土微生物呼吸速率受DBP污染的促進；DBP污染顯著增加黑土微生物碳含量，微生物氮呈現波動降低，微生物磷受到顯著抑制；DBP對黑土多酚氧化酶表現為先促進后抑制；DBP對過氧化氫酶和蛋白酶活性表現為低濃度促進而高濃度抑制；在DBP污染過程中脲酶呈現激活效應；黑土轉化酶和酸性磷酸酶均受到DBP污染的顯著抑制。且土壤微生物量、土壤酶活性與DBP污染濃度之間存在相關性，有著緊密聯系。因此，DBP污染改變了黑土呼吸、微生物量和酶學活性的代謝特征，進而有可能影響了黑土的生態系統功能，威脅到黑土的可持續利用。

致謝：Kui Chen教授在論文寫作過程中給予了指導與幫助，在此謹表謝忱！

通訊作者簡介：張穎(1972—)，女，環境科學與工程博士，教授，博士生導師，主要研究方向農業環境保護，發表學術論文近200篇。

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◆

Response of Microbial Biomass and Enzyme Activities in Black Soil to Di-n-butyl Phthalate Contamination

Wang Zhigang1, Zhao Xiaosong1, Xu Weihui1, Su Yunpeng1, You Yimin1, Liu Shuai1, Hu Ying1, Hu Yunlong1, Zhang Ying2,*

1. Institute of Life Science and Agriculture and Forestry, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China 2. Institute of Resource and Environment, Northeast Agriculture University, Harbin 150001, China

20 August 2015accepted 26 October 2015

Di-n-butyl phthalate (DBP), one of the phthalate esters, is ubiquitous environmental pollutant, and it is listed as an environmental priority pollutant by China State Environmental Protection Administration. The purpose of this study is to estimate the impact of DBP contamination on respiration, microbial biomass and enzyme activity in black soil. The results showed that the microbial respiratory rate and the content of the microbial biomass C in the black soil were promoted by the DBP contamination. The content of the microbial biomass N fluctuated greatly under the DBP contamination. The content of the microbial biomass P was correlated negatively with the DBP concentration. Further, the activity of polyphenol oxidase was promoted after the inhibition occurred at the beginning. The activities of protease and invertase were promoted by the low DBP concentration, but inhibited by the high DBP concentration. The activity of urease was activated by DBP in the black soil. The activities of catalase and acid phosphatase was significantly inhibited by the DBP contamination in the black soil. The correlation analysis showed the correlation among the soil microbial biomass, the soil enzyme activity and the DBP concentration. According to the results, DBP could be the key factor that alters the metabolism of the microorganisms in the black soil, and impacts the ecosystem functions in the black soil.

di-n-butyl phthalate (DBP); soil respiration; microbial biomass; soil enzyme; black soil; contamination

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2012AA101405)；黑龍江省青年科學基金(QC2013C032)

王志剛(1980-)，男，副教授，碩士生導師，研究方向為環境微生物學，E-mail: wzg1980830@sina.com

Corresponding author)， E-mail: zhangying@hotmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150820001

2015-08-20 錄用日期：2015-10-26

1673-5897(2015)6-199-08

X171.5

A

王志剛，趙曉松，徐偉慧, 等. 黑土微生物量和酶活性對鄰苯二甲酸二丁酯污染的響應[J]. 生態毒理學報，2015, 10(6): 199-205

Wang Z G, Zhao X S, Xu W H, et al. Response of microbial biomass and enzyme activities in black soil to di-n-butyl phthalate contamination [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 199-205 (in Chinese)