十八味訶子利尿丸中姜黃的HPLC定性定量研究

段廣佩 張幸福

（1青海省藥品檢驗檢測院 青海 西寧 810016）

（2青海省中藏藥現代化研究重點實驗室 青海 西寧 810016）

十八味訶子利尿丸是以訶子、姜黃、余甘子、紅花等十八味中藏藥材制成的復方制劑，主要功效為益腎固精、利尿，用于腎病、糖尿病、遺精等癥[1]。研究表明其對通?？股仉y抑制的耐藥菌和真菌抑制效果較好,尤其是對白色念珠菌抑制效果最好[2]。姜黃的主要活性成分為姜黃素，姜黃素為橙黃色結晶粉末，經醫學研究，姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用，國際上近年對其研究愈加重視[3-5]。本文建立了十八味訶子利尿丸中姜黃的HPLC定性方法，并對姜黃素進行了HPLC定量測定。定性鑒別方法專屬性強，定量方法準確，可有效控制該藥中姜黃的質量。

1.儀器與材料

島津高效液相色譜儀（LC-20ATVP型）；電子天平(SartriousBT224S,德國Sartrious公司)；電子天平(XS105DU，德國Sartrious公司)，超聲波清洗器（KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司）；姜黃素（供含量測定用，購自中國藥品生物制品鑒定所，批號）。乙腈為色譜純（市售），其余試劑為分析純（市售），水為超純水。十八味訶子利尿丸樣品十批，分別來自青海格拉丹東藥業有限公司等7家企業。

2.方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗[6-8]

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；色譜柱：ZORBAX Eclipse×DB—C18（250mm×4.6mm）；4%冰醋酸溶液-乙腈(54:46)為流動相；柱溫：25℃；檢測波長為430nm。理論板數按姜黃素峰計算應不低于10000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取姜黃素對照品0.00545g，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻（每1ml含姜黃素0.0545mg），即得儲備液。精密量取儲備液10ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（每1ml含姜黃素0.0109 mg）。

2.3 姜黃對照藥材溶液的制備

取姜黃粗粉約50mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取本品細粉約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.5 陰性溶液的制備

按處方比例稱取除去姜黃以外的其他藥材適量，依照十八味訶子利尿丸供試品溶液的制備方法，制成陰性對照溶液。

2.6 檢測波長的選擇

利用高效液相色譜-二極管陣列(DAD),根據姜黃素的光譜圖進行選擇,姜黃素在430±2nm處有最大吸收，因此選擇430nm為檢測波長。

2.7 測定法

按上述色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、姜黃對照藥材溶液、供試品溶液、陰性溶液各10μl，分別注入液相色譜儀。供試品溶液色譜圖中，在與姜黃素對照品色譜峰相應的位置上，有相同的色譜峰；在與姜黃對照藥材色譜峰相應的位置上，有保留時間相同的三個相鄰的主色譜峰；而陰性溶液在此無干擾。色譜圖見圖。

圖 十八味訶子利尿丸中姜黃素色譜圖

2.8 線性關系考察

取上述已配制好的姜黃素（濃度為0.0109mg/ml）對照品溶液。在上述色譜條件下，測定峰面積。以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程為：y=7930626.771035X-3382.771035，R=1.0000；結果表明姜黃素進樣量在0.0109～0.3866μg的范圍內有良好的線性關系，見表。

2.9 精密度試驗

精密吸取姜黃素對照品溶液（濃度為0.0109mg/ml），連續進樣5次，每次進樣量為10μl,測得姜黃素峰面積，平均值859005。表明姜黃素精密度良好，RSD為0.54%（n=6）。

2.10 穩定性試驗

取供試品溶液（青海省格拉丹東藥業有限公司生產，批號0907108，），于不同時間內進樣測定峰面積，結果表明供試品中姜黃素在24h內穩定性良好，RSD為1.30%（n=12）。

2.11 重復性試驗

取十八味訶子利尿丸細粉（西藏神猴藥業有限責任公司生產，批號20100101，），精密稱取6份，按上述方法制成供試品溶液并測定姜黃素含量，結果該份樣品平均含量0.6227%，結果表明：供試品重現性良好。RSD為1.7%。

2.12 加樣回收率試驗

分別精密吸取1.70ml姜黃素對照品儲備液（0.0545mg/ml）各6份，置100ml錐形瓶中，蒸干溶劑。取已知含量的十八味訶子利尿丸樣品約0.25g（西藏神猴藥業有限責任公司生產，批號20100101，姜黃素含量為0.6227mg/g），精密稱定，分別置上述錐形瓶中，制成供試品溶液，并按上述色譜條件測定姜黃素的含量，計算回收率。結果平均回收率為100.04%，RSD=1.06%，回收較好。

2.13 樣品含量測定

取所有樣品細粉，照上述方法制成供試品溶液。按上述色譜條件測定，計算姜黃素的含量。測定結果見表。

表 樣品姜黃素測定結果

2.14 藥材的測定

取7個生產企業的姜黃藥材細粉，照上述方法制成供試品溶液。按上述色譜條件測定，結果6家生產企業的姜黃藥材出現保留時間一致的三個色譜峰，姜黃素含量范圍為0.65%～1.39%

2.15 十八味訶子利尿丸中姜黃的HPLC鑒別

取“2.2”和“2.4”項下的供試品溶液和對照品溶液，另取姜黃對照藥材粗粉約50mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。按上述色譜條件進樣。供試品溶液色譜中，在與姜黃素對照品色譜保留時間一致的位置上，有相同的色譜峰；在與姜黃對照藥材色譜峰相應的位置上，有保留時間相同的三個相鄰的主色譜峰；而陰性溶液在此無干擾。

3.討論

對姜黃藥材按藥材做了原粉和水煮兩種方法的考察，結果表明水煮會使姜黃素含量降低約14倍。

通過比較姜黃素的含量后發現，不同企業所生產的十八味訶子利尿丸中姜黃色含量存在一定差異。

對樣品進行的HPLC鑒別結果表明，大多數廠家的樣品中，均出現與姜黃對照藥材保留時間一致的三個色譜峰，且陰性無干擾，部分企業所提供的姜黃藥材和十八味訶子利尿丸中只出現姜黃色的色譜峰，表明企業所用姜黃藥材需要進一步考察。