輻射對甘藍型油菜下胚軸再生的影響

范春麗，王 穎

（1. 鄭州師范學院 生命科學學院，河南 鄭州 450044；2. 廣東石油化工學院化學與生命科學學院，廣東 茂名 525000）

植物離體培養和誘發突變相結合是植物品質改良的途徑之一[1]。以組織培養為基礎的離體誘變技術能有效地篩選并可再生出遺傳性穩定的突變植株[2]，離體培養可以促進變異的分離和純化，縮短育種周期從而提高育種頻率[3-4]。目前誘變與生物技術相結合已成為發展趨勢，誘變技術的新發展與植物生物技術科學息息相關[5]。把植物生物技術引進到誘變育種中來，將使后者的處理對象從種子、植株或其他器官組織擴大到細胞與DNA 分子上，大大拓寬誘變處理的工作領域，推動誘變技術朝縱深方向發展，把誘變育種推到一個嶄新的境界。隨著分子生物學技術的發展，這些技術應用到植物誘變育種上來，使高等植物的突變機理在DNA 水平上得到深刻的闡明，從而可望解決植物誘變育種的定向突變問題。但是，關于誘變處理與組織培養合適結合方式，處理條件、時期及變異體的選擇方式等一系列問題都有待進行廣泛深入的研究，以形成新的育種途徑。油菜是我國最重要的油料作物，但輻射對油菜離體培養效應的研究還沒有報道，試驗采用60Co-γ 射線對種子和預培養的外植體進行輻射，探討輻射對下胚軸再生的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為兩個甘藍型黃籽油菜品種SH31 和K81，一個甘藍型黑籽油菜品種P52，其中K81 為雙單倍體。材料均由西南大學油菜研究中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 輻射種子 將種子裝入小型塑料瓶中進行輻射，劑量率為1.809 7 Gy/min，劑量設置0、400、800、1200 Gy，輻射后種子用75%酒精處理1 min，無菌水沖洗后用0.1%HgCl2滅菌12 m in，無菌水沖洗3次，播種于無激素的MS 培養基上，培養7 d 后取無菌苗的下胚軸切成0.5～1 cm 的小段接種于預培養基，4 d 后，轉入分化培養基培養，30 d 后統計出芽數。

1.2.2 輻射下胚軸 未經輻射的無菌苗培養7 d，取下胚軸切成0.5～1.0 cm 的小段接種于預培養基上，培養2～4 d 后輻射，劑量率為1.809 7 Gy/m in，劑量設置0、10、20、30、40、50、60、80、100 Gy。輻射后轉入分化培養基，30 d 后統計出芽數。

2 結果與分析

2.1 輻射種子對下胚軸分化的影響

輻射后的種子經培養萌發出幼苗，切取下胚軸進行預培養，4 d 后轉入分化培養基，從表1 中可看出，出芽率隨著輻射劑量的增加而降低，輻射對愈傷組織誘導影響不大，分化受到較大的影響，經1 200 Gy 照射后下胚軸分化頻率下降至62.90%，比對照低20.57個百分點。這表明，輻射種子降低了下胚軸的分化能力。

表1 輻射種子對下胚軸分化的影響

2.2 輻射下胚軸段對下胚軸再生的影響

切取無菌苗下胚軸經預培養后，用不同劑量的γ射線輻射，結果從表2 中可以看出，低劑量的輻射對愈傷組織誘導沒有大的影響，但可促進芽的再生，10～30 Gy 輻射對芽的再生均有促進作用，以20 Gy 輻射效果最明顯，再生頻率提高近9個百分點，且比對照提前3～5 d 出芽。但是高劑量的輻射卻抑制芽的再生，輻射后3 d，40 Gy 以上劑量照射的下胚軸均出現褐化現象，且芽再生率呈下降趨勢；超過80 Gy 輻射，下胚軸褐化嚴重，愈傷組織很少形成，但仍有少量再生出芽；100 Gy 輻射后下胚軸大部分褐化死亡，外植體極少形成愈傷組織，也基本上沒有芽再生；100 Gy照射后的，基本上沒有芽再生。

2.3 不同品種對下胚軸輻射的影響

輻射對離體培養產生的效應，不同品種間差異很大，以40 Gy 輻射為例，在照射后3 d，K81 和SH31 就出現褐化現象，其中K81 在低劑量20 Gy 就出現褐化現象，P52 在40 Gy 照射后，僅出現輕微的褐化，從出芽率來看，黑籽品種P52 經照射后，出芽率降低13.02個百分點，SH31 降低31.43個百分點，K81 降低44.66個百分點，這表明不同品種對輻射的敏感性不同，P52更耐輻射。

2.4 預培養時間對下胚軸段輻射的影響

未經輻射處理的下胚軸預培養2 d 和4 d 對分化影響不大[6]，但預培養時間對下胚軸再生的影響很大。由表4 可看出，預培養2 d 后輻射，下胚軸再生頻率明顯低于預培養4 d 后輻射。并且劑量越高影響越明顯，預培養2 d 后40 Gy 照射，出現大量褐化死亡，在80 Gy 以上沒有再生出苗。這說明4 d 時間的預培養有利于降低輻射對外植體的損傷，從而有利于芽的再生。

表2 輻射下胚軸段對下胚軸再生的影響

表3 不同品種對下胚軸輻射再生的影響

表4 預培養時間對下胚軸輻射再生的影響

3 小結與討論

近年來，組培技術和誘變技術相結合在農作物、蔬菜、果樹和育種上大量應用，培育出不少新品種[7-11]。在水稻中低劑量的輻射愈傷組織，可提高愈傷組織的分化頻率[12]，青菜預培養的外植體經低劑量輻射處理后能促進不定芽的再生[13]。另有研究表明，在大豆的基因槍介導轉化中，低劑量的輻射處理可提高轉化成功率。對于油菜再生和農桿菌轉化的研究，已經取得了一定的進展，但普遍存在再生頻率較低的現象。本試驗結果表明下胚軸預培養4 d 后，采用20 Gy γ 射線輻射處理，可明顯提高油菜下胚軸的再生頻率，40 Gy 以上劑量處理預培養的下胚軸，再生頻率開始下降，60 Gy 以上輻射處理，愈傷組織誘導和再生受到明顯的抑制，80 Gy 輻射處理后沒有再生出苗，這對后期篩選變異是很有意義的。不同品種在離體培養中對輻射的效應存在較大差異，其中黑籽油菜較黃籽油菜耐輻射，這與種子輻射的結果是一致的。

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