抗重金屬鎘微生物特性的研究

盧福芝，李啟虔，劉王輝，周婷婷，李羅春，李靜蘭

(河池學院 化學與生命科學系，廣西 宜州 546300)

鎘是一種比較稀有的元素，應用較為廣泛，常用于生產鎘電池、塑料、顏料和試劑等[1]。但是，鎘也是一種對人體和動物危害極大的元素，已被列入美國環保署水環境中優先污物、空氣中重點控制的有害污染物名單及我國有毒化學品的優先登記名單[2]。環境中鎘的自然來源很少，但隨著采礦、冶煉等工業的發展，越來越多的鎘被排放出來。據調查顯示，在礦區及冶煉廠附近的環境中檢測到的鎘濃度比其他地區要高得多[3]。在污染地區鎘中毒的事件常有發生，鎘對人體的毒害引起了世界各國的重視。

目前，科學家們對由鎘等重金屬造成環境污染的修復研究正如火如荼地進行，其中以生物修復技術中利用微生物進行重金屬污染修復是研究的熱點[4－5]。Hassan SW(2012)，鄭曉丹(2010)，Zhang J.(2010)，Al－Garni S(2009)，Hassan SW(2009)研究表明微生物對重金屬具有較好的吸附性，在重金屬污染修復中將發揮重要的作用[6－10]。本研究以實驗室保藏的抗鎘淡紫擬青霉菌(Paecilomyces lilacinus)LLC4為出發菌株，研究培養溫度，初始pH，不同Cd2+濃度對其生長的影響以及不同Cd2+濃度生長中pH及吸附率的影響，為該菌應用于重金屬污染修復提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

實驗室保藏的抗鎘菌株:淡紫擬青霉菌(Paecilomyces lilacinus)LLC4，抗Cd2+濃度為268 mmol/L。

1.2 培養基

YPG培養基(L):蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，酵母提取物5 g，固體培養基時加入瓊脂粉15 g，去離子水定容至1000 mL，pH自然，121℃高壓滅菌20 min。

1.3 培養溫度對菌株生長的影響

將活化后的菌株LLC4接種到YPG培養基固體平板上，同時將其分別放入溫度為25℃、28℃、32℃、35℃、38℃的恒溫培養箱中倒置培養，培養3 d后觀察菌落的生長情況，并用游標卡尺測量菌落的直徑。

1.4 不同初始pH對菌株生長的影響

配制pH為5、6、7、8、9、10的YPG固體培養基，將活化后的菌株LLC4分別接種到不同pH的YPG培養基固體平板上，倒置于28℃恒溫培養箱中培養，培養3 d后觀察菌落生長情況，并用游標卡尺測量菌落的直徑。

1.5 不同Cd2+濃度對菌株生長量的影響

將活化好的菌株LLC4接入YPG液體培養基中，28℃，180 rpm培養3 d后收集濕菌體。分別稱取1 g濕菌體接入含0 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L Cd2+的100 mL YPG液體培養基中，28℃，180 rpm培養，每隔8 h取樣，抽濾收集培養液中的菌體，將菌體置于35℃干燥箱中進行干燥后稱量干菌體的重量，記錄菌株從接種始至7 d內干菌體的量。

1.6 不同Cd2+濃度對菌株生長中pH的影響

按照1.5的方法將菌株LLC4接入含不同Cd2+濃度的YPG液體培養基中培養，定期取樣測定培養液中的pH，檢測不同Cd2+濃度對菌株生長中pH的影響。

1.7 菌株對Cd2+吸附率的測定

1.7.1 原子吸收法測鎘標準曲線的制作

將1000 μg/mL的鎘標準溶液稀釋至10 μg/mL，取6個250 mL的容量瓶，用1% 的優級純硝酸溶液將10 μg/mL的鎘標準溶液分別稀釋至0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L，用1%的硝酸作為空白對照。用原子火焰吸收法直接測定鎘標準液的吸光度，得到的標準曲線如圖1所示。

圖1 鎘的標準曲線

根據上述方法得到標準曲線的線性相關系數R2=0.99758，曲線方程:Y=0.1651*X+0.0032，具有很好的線性關系。

1.7.2 活菌體對Cd2+吸附率的測定

將活化后的菌株LLC4濕菌體1 g接種至不含Cd2+的YPG液體培養基中，28℃，180 rpm培養2 d，使菌體達到一定濃度后加入 Cd(NO3)2溶液，使培養液中 Cd2+的終濃度分別為5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L，以不加菌體僅加入相應濃度Cd2+的培養基為空白對照。加入Cd2+后繼續振蕩培養2 d后離心，用火焰原子吸收法測定上清液中Cd2+的濃度(空白對照中Cd2+的濃度用C0表示，加入菌體上清液中Cd2+的濃度用C1表示)，檢測菌株對Cd2+的吸附率[11]。

1.7.3 失活菌體對Cd2+吸附力的測定

為了檢測失活菌體對Cd2+的吸附作用，將活化后的菌株LLC4濕菌體1 g接種至不含Cd2+的YPG液體培養基中，28℃，180 rpm培養2 d后，將培養液進行濕熱滅菌滅活其中的菌體，而后向滅菌培養液中加入Cd(NO3)2溶液，使培養液中Cd2+的終濃度為10 mmol/L，按1.7.2的方法測定菌株的吸附率。

2 結果與分析

2.1 培養溫度對菌株生長的影響

菌株LLC4置于不同溫度中培養3 d后，用游標卡尺測定菌落的直徑大小，每個溫度的菌落直徑均取平均值，結果如表1所示。

表1 不同溫度培養下菌株的菌落直徑

由表1可知，隨著培養溫度的升高，菌株LLC4的菌落直徑先由小變大，然后再變小，且變化較為明顯，說明培養溫度對其生長影響較大。當培養溫度為28℃時，菌落直徑最大，達17 mm，說明在此溫度下菌落生長最好。由此可知，菌株LLC4的最適培養溫度為28℃。

2.2 不同初始pH對菌株生長的影響

菌株LLC4置于不同pH中培養3 d后，用游標卡尺測定菌落的直徑大小，每個pH的菌落直徑均取平均值，結果如表2所示。

表2 不同初始pH培養下菌株的菌落直徑

由表2可知，隨著初始培養pH的升高，菌株LLC4的菌落直徑先由小變大，然后再變小，但變化不大。這說明菌株LLC4有較廣的pH適應范圍，培養初始pH對其生長影響不明顯。由于用于培養菌株LLC4的YPG培養基天然pH在5.5左右，因此為了培養及研究方便，均使用pH天然的YPG培養基培養該菌株。

2.3 不同Cd2+濃度對菌株生長量的影響

將活化好的菌株LLC4 1 g濕菌體接入YPG液體培養基后，每隔8 h取樣用抽濾機收集濕菌體后干燥至恒重稱取其干菌體質量，結果如圖2所示。

由圖2可看出，在初期，不同Cd2+濃度培養干菌體的質量都呈快速上升趨勢。含Cd2+0 mmol/L的培養基中培養的菌體干重在80～88 h達最大值0.99 g，含Cd2+10 mmol/L的培養基中培養的菌體干重在88～112 h達到最大值1.32 g，含Cd2+20 mmol/L的培養基中培養的菌體干重在96～112 h均達到最大值0.95 g。隨著培養時間的延長，由于菌體老化自溶，在三種Cd2+濃度中培養的菌體干重均呈現不同的下降趨勢，但在含Cd2+0 mmol/L、10 mmol/L的培養基中培養的菌體干重下降較快，在含Cd2+20 mmol/L的培養基中培養的菌體干重后期緩慢下降，這是由于菌株在高濃度Cd2+中生長受到一定抑制，使得其生長周期延長。從整個培養過程看，在含Cd2+10 mmol/L的培養基中培養的菌體干重明顯比另外兩個Cd2+濃度中培養的菌體干重要大，說明低濃度的Cd2+對菌株LLC4的生長有促進作用，而在含Cd2+20 mmol/L的培養基中比在0 mmol/L中培養的菌體干重整體要小些，說明高濃度的Cd2+會抑制菌株LLC4的生長。

2.4 不同Cd2+濃度對菌株生長中pH的影響

將活化好的菌株LLC4 1 g濕菌體接入YPG培養基培養后，每隔8 h取樣測定培養液中的pH，結果如圖3所示。

由圖3可知，在培養過程中不同Cd2+濃度中培養液pH均呈先下降后快速上升趨勢，而后又稍有下降。菌株在含Cd2+0 mmol/L中培養，培養液的pH在0～40 h處于下降趨勢，而后上升，在152 h達最大值9.11;在含Cd2+10 mmol/L中培養，培養液的pH在0～32 h處于下降趨勢，而后上升，在160 h達最大值8.91;在含Cd2+20 mmol/L中培養，培養液的pH在0～24 h處于下降趨勢，而后上升，在120 h達最大值7.13。菌株在培養過程中培養液pH發生變化是由于其生長過程中代謝發生變化，pH下降可能是代謝中產生有機酸類的中間代謝物，pH上升可能是發生了轉氨作用產生堿性的代謝產物。在整個培養過程中，由圖3明顯看出隨著Cd2+濃度的升高，培養液中的pH先下降后上升的趨勢要快，但整個過程pH的變化幅度變小，說明培養基中Cd2+濃度的高低對菌株LLC4的代謝活動有較為重要的影響。

圖2 不同Cd2+濃度對菌株生長量的影響

圖3 不同Cd2+濃度對菌株生長中pH 的影響

2.5 菌株對Cd2+吸附率的測定

按照1.7.2和1.7.3的方法分別測定菌株LLC4的活菌體和失活菌體對Cd2+的吸附率，其測定結果如表3所示。

表3 菌株對Cd2+的吸附率

由表3可知，活菌體在初始Cd2+濃度為5 mmol/L的培養基中，28℃，180 rpm進行吸附實驗，48 h后吸附率達65.17%。隨著培養基中初始Cd2+濃度增加，菌體的吸附率降低。這是因為菌體細胞對重金屬的吸附量是有限的，菌體吸附量到達一定程度后吸附速度會降低，達到飽和后將不在吸附甚至有可能會將重金屬解吸出來。此外，過高的Cd2+濃度會影響菌體的生長繁殖從而導致吸附率降低。表3中顯示失活的菌體對Cd2+的吸附率為3.10%，說明將菌體進行滅活處理后仍可吸附一定Cd2+，但吸附率遠比活菌體的低，這結果與 Tangaromsuk[12]和曾曉希[13]等的研究結果一致。

3 總結與展望

3.1 總結

以實驗室保藏的一株抗鎘淡紫擬青霉菌(Paecilomyces lilacinus)LLC4為出發菌株，經研究得出菌株LLC4最適培養溫度和初始pH分別為28℃和8;低濃度Cd2+對菌株LLC4的生長有一定的促進作用，當初始培養Cd2+濃度為10 mmol/L時，其有較好生長量;Cd2+會影響菌株LLC4的代謝活動進而使培養液中pH發生變化，Cd2+濃度越高，整個培養過程培養液中pH變化范圍越小;菌株LLC4對Cd2+的吸附率隨Cd2+濃度的增加而降低，在初始Cd2+為5 mmol/L時，培養48 h后對Cd2+的吸附率最大，達65.17%。

3.2 展望

處于礦區中的微生物，由于長期受到環境中重金屬的脅迫，往往會對重金屬產生一定的抗性作用，有些微生物甚至可以將重金屬吸附進體內進行轉化以降低其毒害作用。因此可從礦區中篩選出對重金屬有較強抗性的微生物，研究抗性菌株的生長及吸附活化重金屬特性，為利用微生物修復重金屬污染提高理論研究基礎。本論文的研究內容還屬于初始的基礎階段，今后可往以下幾個方面進行深入的研究:

(1)研究菌株LLC4吸附水中鎘的最佳條件，如吸附時的溫度、pH、轉速、菌體量等;

(2)檢測菌株LLC4對混合重金屬的耐受性及同時吸附多種重金屬的條件;

(3)開展菌株LLC4對土壤中重金屬的吸附研究，并可結合植物進行聯合吸附實驗。

[1]劉麗.耐Cu、Cd微生物的分離篩選及其吸附機理研究[D].合肥:合肥工業大學，2010.

[2]隆美容，謝小林，馮廣達，等.鉛鋅尾礦中耐重金屬鎘的絲狀真菌的分離鑒定[J].微生物學通報，2013，40(12):2203－2216.

[3]Brookes P C.Mcgrath S P.Effect of metal toxicity on the size of the soil microbial biomass[J].J.Soil Sei，1984，35:341.

[4]金忠民，郝宇，劉麗杰，等.一株鉛鎘抗性菌株的分離鑒定及其生物學特性[J].環境工程學報，2015(7):3551－3557.

[5]R N N Abskharon，S H A Hassan，S M F Gad EI－ Rab，et al.Heavy metal resistant of E.coli isolated from wastewater in sites in assiut city，E-gypt[J].Bull Environ Contam Toxiclol，2008，81:309 － 315.

[6]Hassan SW，El－ Kassas HY.Biosorption of cadmium from aqueous solutions using a local fungus Aspergillus cristatus(glaucus group)[J].African Journal of Biotechnology，2012，11(9):2276 －2286.

[7]鄭曉丹.變形假單胞菌吸附鎘的機制及其吸附條件的研究[D].福州:福建師范大學，2010.

[8]Zhang J，Min H.Characterization of a multimetal resistant Burkholderia fungorum isolated from an e－waste recycling area for its potential in Cd sequestration[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26(2):371 －374.

[9]Al－ Garni S，Ghanem K，Bahobail A.Biosorption characteristics of Aspergillus fumigatus in removal of cadmium from an aqueous solution[J].African Journal of Biotechnology，2009，8(17):4163 －4172.

[10]Hasan SH，Bhattacharjee BN，et al..Biosorption of Cd(Ⅱ)from Water Using Citrobacter koseri[J].IFMBE Proceedings，2008，21(4):833 －837.

[11]奚旦立，孫裕生.環境監測(第4版)[M].北京:高等教育出版社，2010.

[12]Tangaromsuk J，Pokethitiyook P，Knlatrachue M，et al.Cadmium biosorption by Sphingomonas paueimobilis biomass[J].Biore － source Teehnology，2002，85:103 －105.

[13]曾曉希.抗重金屬微生物的篩選及其抗鎘機理和鎘吸附特性研究[D].長沙:中南大學，2010.