蠲痹湯對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型細(xì)胞因子的影響

俞琦　蔡琨　王文佳

【摘要】目的：觀察蠲痹湯對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）、血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平的影響，探討蠲痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的免疫機(jī)制。方法：將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、甲氨喋呤對(duì)照組、蠲痹湯高/低劑量組，制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，給藥組以不同劑量蠲痹湯灌胃，對(duì)照組代以生理鹽水，檢測(cè)AI、血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的表達(dá)。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯上升，IL-10、IL-4水平明顯下降（P<001）；與模型對(duì)照組比較，蠲痹湯高、低劑量均能明顯降低實(shí)驗(yàn)大鼠AI和血清TNF-α、IL-1β水平（P<005或P<001），對(duì)IL-4水平無影響（P>005），蠲痹湯高劑量組能顯著升高模型大鼠IL-10水平（P<001）。結(jié)論：蠲痹湯對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠TNF-α等炎癥因子具有干預(yù)作用，提示蠲痹湯可通過抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1的表達(dá)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌，從而達(dá)到治療RA的效果。

【關(guān)鍵詞】蠲痹湯；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；大鼠模型；細(xì)胞因子

【中圖分類號(hào)】R2855【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2015）14-0001-02

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）屬難治性疾病，臨床多采用化學(xué)藥物或生物制劑進(jìn)行治療，但療效不穩(wěn)定。蠲痹湯出自清代程國彭所著《醫(yī)學(xué)心悟》，由獨(dú)活、桂心、秦艽、當(dāng)歸、川芎、炙甘草、海風(fēng)藤、桑枝、乳香、木香組成，具有祛風(fēng)除濕、益氣活血、蠲痹止痛等功效，是臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的常用方劑，療效顯著[1-3]。為探討其作用機(jī)制，本研究通過制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，以血清細(xì)胞因子為觀察指標(biāo)，觀察蠲痹湯對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的免疫調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步研究蠲痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠50只（180±20）g（雌雄分籠），由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK（黔）2002-0001]。

12藥材與試劑蠲痹湯：按原方比例常規(guī)方法制備水煎劑，調(diào)整濃度為01g生藥/ml，濾過除菌，置4℃?zhèn)溆?；甲氨喋呤（上海華聯(lián)制藥有限公司）；完全福氏佐劑（Sigma公司）；大鼠細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4檢測(cè)試劑盒（上海拜力生物科技有限公司）。

13儀器EIX808U型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國BioTek）。

2實(shí)驗(yàn)方法

21動(dòng)物分組動(dòng)物購回適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組。正常對(duì)照組大鼠10只；模型組大鼠40只，造模后又隨機(jī)分為模型對(duì)照組、甲氨喋呤對(duì)照組、蠲痹湯高劑量組、蠲痹湯低劑量組，每組10只。

22大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的制備[4]模型組大鼠左后足跖皮內(nèi)注射完全福氏佐劑，01ml/只，建立佐劑性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠病理模型。

23給藥方法造模后第7d，甲氨喋呤對(duì)照組按12mg/kg灌服，1次/d，連續(xù)2周；蠲痹湯高、低劑量組分別按22g/kg、11g/kg灌服，1次/d；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服等量生理鹽水，每天一次，連續(xù)給藥2周。

24關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）的計(jì)算[5]大鼠致炎后第12d開始觀察并記錄關(guān)節(jié)病變程度，每4d1次，病變按5級(jí)分法評(píng)價(jià)，根據(jù)未注射佐劑的余下肢體的病變程度累計(jì)積分，計(jì)算出AI。0分：無紅腫；1分：小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。把各個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來，即為每只大鼠的AI。

25指標(biāo)檢測(cè)末次灌胃12h后開始禁食（不禁水），24h后股靜脈取血，分離血清，細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平的檢測(cè)均按試劑盒說明書操作。

26統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS170軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<005表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響由表1可知，致炎后16d，蠲痹湯高劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著低于模型對(duì)照組（P<005）；致炎后20d，蠲痹湯高、低劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均較模型對(duì)照組明顯降低（P<005）；從致炎16d起，蠲痹湯高、低劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)與甲氨喋呤對(duì)照組近似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）。

32對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血清細(xì)胞因子水平的影響由表2可知，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β水平明顯上升，IL-10、IL-4水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）；與模型對(duì)照組比較，蠲痹湯高、低劑量組均能明顯降低RA模型大鼠血清TNF-α、IL-1β水平（P<001或P<005），對(duì)IL-4水平均無影響（P>005）。蠲痹湯高劑量組能顯著升高模型大鼠IL-10水平（P<001）。

4討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性自身免疫性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。多因風(fēng)寒濕熱等外邪侵襲人體，閉阻經(jīng)絡(luò)，氣血運(yùn)行不暢所致。本病較為常見，且是頑固的慢性關(guān)節(jié)炎癥性病變，常侵犯四肢小關(guān)節(jié)，可引起全身的關(guān)節(jié)腫脹疼痛及功能障礙，并可伴有關(guān)節(jié)外的系統(tǒng)性損害，是致殘性疾病之一。臨床上多采用化學(xué)藥物或生物制劑進(jìn)行治療，但其毒副作用明顯、患者難以長期耐受，且療效不穩(wěn)定。近年來，用中醫(yī)中藥辨證治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎取得很好療效。蠲痹湯源自《醫(yī)學(xué)心悟》，由獨(dú)活、桂心、秦艽、當(dāng)歸、川芎、炙甘草、海風(fēng)藤、桑枝、乳香、木香組成，是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎常用方劑，療效顯著。

研究表明，在RA的發(fā)病過程中，細(xì)胞因子的失調(diào)占有重要的地位，TNF-α、IL-1β主要由單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌，使外周血和關(guān)節(jié)滑液中IL-1β和TNF-α升高。IL-1β和TNF-α是炎癥、組織損傷及免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)，在RA的發(fā)病機(jī)理中居中心地位，參與RA的發(fā)生發(fā)展過程，二者相互協(xié)調(diào)、促進(jìn)，在多數(shù)情況下表現(xiàn)協(xié)同性生物學(xué)效應(yīng)[6]。表達(dá)的IL-1β和TNF-α可刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬酶、膠原酶等，導(dǎo)致滑膜炎癥和軟骨破壞，同時(shí)可激活破骨細(xì)胞，使骨質(zhì)溶解[7]。IL-4和IL-10是兩種抗炎癥的Th2型細(xì)胞因子，可負(fù)調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞的功能，抑制Th1增生，抑制IL-1β、TNF-α和其他一些炎癥性細(xì)胞因子的功能和生成。IL-10、IL-4在RA病變中含量明顯降低。實(shí)驗(yàn)和臨床觀察證實(shí)，糾正促炎癥細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子的平衡失調(diào)狀態(tài)，可以緩解或阻止關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生和發(fā)展[8]。

本研究結(jié)果顯示，致炎20d后，與模型對(duì)照組比較，蠲痹湯高、低劑量均能顯著降低實(shí)驗(yàn)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（P<005）；從致炎16d起，蠲痹湯高、低劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)與甲氨喋呤對(duì)照組近似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005），表明蠲痹湯能抑制大鼠RA的繼發(fā)病變。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯升高，IL-10、IL-4水平明顯降低（P<001），提示模型大鼠淋巴細(xì)胞免疫功能下降，炎性細(xì)胞因子分泌增多，抗炎性細(xì)胞因子減少，促進(jìn)了RA的發(fā)生發(fā)展。與模型對(duì)照組比較，蠲痹湯高、低劑量能明顯降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清TNF-α、IL-1β水平（P<001或P<005），蠲痹湯高劑量組能顯著升高模型大鼠IL-10水平（P<001），說明蠲痹湯在一定劑量下對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型的免疫功能及紊亂的細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)作用，提示蠲痹湯可通過抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌，從而達(dá)到治療RA的效果。經(jīng)蠲痹湯治療后，模型動(dòng)物IL-4水平不發(fā)生變化，提示其不能調(diào)節(jié)IL-4的表達(dá)。

佐劑性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型與人類RA有較高的相似度，利用該模型對(duì)RA治療藥物篩選具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用佐劑性關(guān)節(jié)炎癥動(dòng)物模型進(jìn)行研究的結(jié)果表明：蠲痹湯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足關(guān)節(jié)病變有顯著抑制作用，其臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1] 王建文.蠲痹湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎60例[J].吉林中醫(yī)藥，2003，23（12）：26.

[2] 史成和，關(guān)曉旭.和血蠲痹湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎90例[J].陜西中醫(yī)，2004，25（7）：614-616.

[3] 肖一公. 自擬祛風(fēng)蠲痹湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效觀察[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2007，19（4）：319-320.

[4] 周軍，方素萍，齊云，等.桂枝湯對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的防治作用研究[J].中藥藥理與臨床，2000，16（6）：319-323.

[5] 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)（第三版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

[6] 李霞，孫健，范成明.細(xì)胞因子與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[J].大連大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21（4）：102-105.

[7] Miossec P1，van den Berg W.Th1/Th2 cytokine balance in arthritis[J].Arthritis Rheum，1997，40（12）：2105-15.

[8] Neurath MF，Hildner K，Becker C，et al.Methotrexate specifically modulates cytokine production by T cells and macrophages in murine collagen-induced arthritis （CIA）： a mechanism for methotrexate-mediated immunosuppression[J].Clin Exp Immunol 1999，115（1）：42-55.

（收稿日期：2015415）