Bio-Rad D-10糖化血紅蛋白分析儀臨床應用常見問題分析

韓紅梅，侯明良

徐州醫學院附屬第三醫院檢驗科，江蘇徐州　221003

Bio-Rad D-10糖化血紅蛋白分析儀臨床應用常見問題分析

韓紅梅，侯明良

徐州醫學院附屬第三醫院檢驗科，江蘇徐州221003

目的 總結D-10糖化血紅蛋白A1c（HbA1c）分析儀在檢測過程中的常見問題和結果分析。方法 回顧分析已檢測樣本及其色譜柱圖。結論 在報告伯樂D-10糖化血紅蛋白分析儀的檢測結果時，要了解該儀器的干擾因素，仔細觀察其色譜柱圖，判斷是否存在血紅蛋白變異體或其他干擾，結合臨床提供更準確更全面的結果解釋。

糖化血紅蛋白；D-10；異常血紅蛋白；血紅蛋白變異體

糖化血紅蛋白（HbA1c）目前被公認是評價糖尿病患者長期血糖控制的 “金標準”，2010年美國糖尿病學會（ADA）已將HbA1c≥6.5%作為糖尿病的診斷標準之一［l］。在我國患有糖尿病的人數較多，因此準確無誤的診斷和治療糖尿病非常重要。目前糖化血紅蛋白檢測的標準化程度越來越高，在臨床糖化血紅蛋白上會得到廣泛應用，HbA1c對糖尿病的診斷以及治療有著重要的意義。臨床實驗室進行HbA1c測定的具體方法包括高效液相色譜法（HPLC）、免疫法、親和層析色譜法和電泳法等，其中高效液相色譜法具有應用范圍非常廣，方法準確性和精確度高的優點。伯樂D-10采用的是離子交換高效液相色譜法檢測HbA1c。

1　實際工作中出現的問題與解決方法

D-10血紅蛋白A1c測定儀采用的是離子交換高效液相色譜法（IE-HPLC），標本類型為2 mL EDTA-K2抗凝靜脈血標本或用稀釋液處理的預稀釋樣本，每個樣本在3 min內即可完成測定，該儀器是通過美國國家糖化血紅蛋白標準化計劃認證的儀器，其參考物質可追溯到對糖尿病的控制和減輕并發癥的臨床研究，可為臨床提供快速準確的HbA1c檢測服務。HbA1c測定的準確性與否直接影響臨床治療的效果，確保HbA1c測定結果的正常極其關鍵。

在實際工作過程，有時會遇到糖化血紅蛋白結果與臨床不符或無法解釋的結果，對于這些情況通過回顧該院多年來累計的HbA1c異常處理數據分析，將我們在實際工作中遇到的問題與解決方法大致分類如下：

1.每次分析的色譜峰下總面積范圍應在1，000，000 到4，000，000 μvolt秒在之間，若超出此范圍則不能報出結果。處理方法：手工稀釋樣本重做，低于1，000，000 μvolt1·秒的樣本，取大于10 uL全血樣本+1.5 mL稀釋液；高于4，000，000 μvolt·秒的樣本，取少于5 uL全血樣本+1.5 mL稀釋液。

2.異常低值（＜4.0）、異常高值（＞18.0）或無A1c峰（unknown峰＞5.0%），提示患者血中存在血紅蛋白變異體。處理方法：患者不適合使用HPLC法測定HbA1c，可更換其他檢測原理的儀器測定（如免疫法），也可建議臨床采用其他替代指標，如糖化血清蛋白、糖化白蛋白或連續監測血糖。另外可再對血紅蛋白變異體類型的檢測，以查明病因。

3.檢測到已知血紅蛋白變異體干擾。D-10可以識別HbF、HbS和HbC等常見的異常血紅蛋白 （見圖1-3），在HbF（＜10%）、HbS和HbC存在時，一般不影響HbA1c檢測的準確性。可是使用的方法以及平臺不同，那么HbS對離子交換色譜法得出的檢測結果也會有不同的影響。其中不受HbS影響的是Tosoh G7、HA8160方法，但對于Bio-RadVariant高效液相系統來說，HbS的影響具有不確定性，有些時候如在HbA1c范圍較低時，糖化血紅蛋白的值就會偏高。也有些時候HbA1c的值由于層析柱及試劑的批次不同就不會受到影響。處理方法：在D-10識別出異常血紅蛋白時，觀察色譜圖，若HbF＜10%，可不作處理，若HbF≥10%，則提示患者不適合測定HbA1c，可建議臨床采用其他與HbA1c等同的指標進行檢測，比如糖化血清蛋白、糖化白蛋白或者全程測定血糖。HbA1c的范圍要適中，檢測時要選擇好層析柱和試劑的批次。圖1-3：

圖1-3　1.HbS峰；2.HbC峰；3.HbF峰

4.檢測結果偏低或偏高。由于糖化血紅蛋白在紅細胞內是連續緩慢合成的，一些疾病會導致紅細胞壽命變短從而也會縮短糖化血紅蛋白形成的時間，檢測結果就會有一定的影響。一些疾病如肝硬化、脾腫大、糖尿病等引起的繼發性溶血，使檢測結果偏低。處理方法：促紅細胞生成素治療和嚴重貧血患者需要進行輸血治療，這也會根據不同的測定方法干擾影響糖化血紅蛋白檢測結果，因此需要選擇合適的檢測方法。Vitamin C和Vitamin E能夠抑制血紅蛋白糖基化，測定結果假性降低。當缺鐵性貧血患者的血糖濃度保持不變、紅細胞數目減少的時候，糖化血紅蛋白測定值升高，使用鐵劑進行治療，100 mg/d十二周后，因幼紅細胞降低了血紅蛋白的濃度，使糖化血紅蛋白平均值下降。

5.L-糖化血紅蛋白是糖化血紅蛋白的初期反應產物，由于其結構不穩定，會因為血糖濃度改變，能夠水解成葡萄糖和血紅蛋白，也能夠繼續反應生成醛胺。因此L-糖化血紅蛋白會影響糖化血紅蛋白的測定結果。因為硼酸鹽親和色譜法以及免疫法不需要測定L-糖化血紅蛋白，所以沒有影響。但離子交換色譜法受到LA1c影響非常大。處理方法：使用溶血劑對全血樣本進行處理，把產物置于37℃的等滲液，在其中進行孵育6 h。或者使用硼酸鹽親和色譜法和免疫法進行檢測。

6.HbA1c變異率非常低，穩定性好，個體內日間差不大，即使標本在室溫下放置3～14 d也不會對測定結果造成非常大的影響。通過檢測不同溫度下保存的全血標本，說明了全血標本4～8℃保存50天內，檢測結果與新鮮標本沒有很大差別；在17～23℃保存7 d后，所測結果則明顯低于新鮮標本；在～20℃下保存28 d后，檢測結果也明顯低于新鮮標本。處理方法：若全血標本不能及時測定，需將其于4～8℃保存，若無特殊情況，最好在15 d內測定標本，那么HbA1c檢測結果可能會相差不大。

7.發病迅速的Ⅰ型糖尿病患者由于血糖在短期內升高到一定水平，而由葡萄糖的游離醛基和末端Valine連接，或葡萄糖的游離醛基和血紅蛋白上的游離Lysine形成席夫堿，然后經過糖基化分子重排，形成具有穩定結構的糖基化產物，合成HbA1c。其反應過程非常緩慢，與血糖達到平衡可能需要幾周時間。但是HbA1c的水平往一般正常或上升極小，并不能準確反映升高的血糖水平。腎病患者由于體內尿素的濃度較高，尿素不需外界條件就能分離形成氨和氰酸鹽，然后氰酸鹽經質子化作用后形成異氰酸，異氰酸與蛋白質的基團進一步反應形成氨基甲酰。Valine可與異氰酸發生特異性的反應，形成氨基甲酰血紅蛋白。如果患者體內的氨基甲酰血紅蛋白濃度高于5.4%，就會對HbA1c的測定產生影響，可能為假性偏高。處理方法：需要詢問患者是否為Ⅰ型糖尿病患者、腎病患者，對Ⅰ型糖尿病患者、腎病患者可能需要其他指標來檢測，不能用離子交換高效液相色譜法進行檢測。

2　結果評價

HbA1c是血紅蛋白在血中與葡萄糖經過長期緩慢的非酶促糖化反應形成的不可逆的酮胺類物質，HbA1c水平與血糖的平均濃度及血紅蛋白的循環壽命相關。由于正常情況下紅細胞在血液循環中的壽命約為120 d，HbA1c可作為是判斷糖尿病長期控制情況的良好指標。在實驗室檢測過程中，需要注意對HbA1c結果正確性的判斷，排除可能存在的干擾因素。

實驗室報告HbA1c結果，需要了解所使用檢測方法的干擾因素。最主要的干擾因素的是異常血紅蛋白（HbF）和血紅蛋白變異體。目前已發現的血紅蛋白變異體超過700種，但最常見的是HbS、HbC和HbE［2］。對采用IE-HPLC法的D-10來說，NGSP網站（http：//www. ngsp.org/factors.asp）公布的具有干擾作用的因素是HbF（＞10%）［3］。因此在儀器提示存在HbF（＞10%）的時候，要避免發出錯誤的結果。對于Bio-RadVariant高效液相系統來說，同時需要注意HbS的影響具有不確定性，可能在HbA1c范圍較低時，糖化血紅蛋白的值就會偏高，也可能由于層析柱及試劑的批次不同而沒有影響。

使用HPLC法檢測HbA1c，報告結果時需要觀察色譜圖。除上述所描述的干擾因素外，還有許多其他病理情況以及未發現的干擾因素，例如慢性腎衰病人、β型地中海貧血病人特殊血紅蛋白變異體［4］等。仔細的閱讀色譜圖，會發現是否存在這些特殊物質，從而避免發出錯誤的報告。同時要注意標本的保存溫度［5］，標本不能及時測定時，需將其在4-8℃保存，才能保證準確性，否則檢測結果會偏低。

實驗室報告結果需要考慮患者臨床情況。某些病理情況下，疾病或會影響紅細胞在血液循環中的壽命，例如急性失血、溶血性貧血會使HbA1c假性降低［6］；缺鐵性貧血會使假性升高［7］。此外輸血、白血病也會間接對HbA1c的水平產生影響［8］。

總之，異常血紅蛋白、血紅蛋白變異體、某些疾病藥物以及其他未知的干擾因素會對實驗室報告的HbA1c結果產生干擾，若得出的報告檢測結果偏低，對測定以及治療高血糖具有很大影響，同時增大并發癥發生的幾率。若得出的報告檢測結果偏高，會使判斷失誤，治療力度過大，反而加大低血糖發生的幾率。所以，檢測人員在得出報告時如果發現出現的結果是HbA1c異常，或與臨床診斷的結果不一致時，為了避免發生干擾，考慮使用其他合適的檢測方法，或建議臨床選擇其他與HbA1c等同的指標進行檢測，比如糖化血清蛋白、糖化白蛋白或者全程測定血糖，保證糖化血紅蛋白的檢測方法可以與臨床需求相一致。如有條件，再繼續進行探究，比如進行血紅蛋白變異體的鑒定等。

3　結語

在使用D-10糖化血紅蛋白分析儀檢測并報告HbA1c結果時；首先要了解所使用檢測方法的干擾因素，其次要仔細觀察色譜圖，判斷是否存在異常血紅蛋白或血紅蛋白變異體，或其他干擾因素；如遇到特殊結果或與血糖不符的結果時，還要結合病人的臨床實際進行綜合判斷，為臨床提供準確的報告以及合理的結果解釋。

［1］American Diabetes Association.Standards of medical care in diabetes 2010［J］.Diabetes Care，2010（33）：11-61.

［2］Brg L，Chem PC，Sacks DB，Effects of Hbvariants and chemically modified derivatives on assay for glycohaemoglobin ［Review］.Clin Chem，2001（47）：153-163.

［3］Little RR，Rohlfing CL，Hanson SE，et al.The Effect of Increased Fetal Hemoglobin on 7 Common HbA1c Assay Methods.Clin Chem，2012（58）：945.

［4］溫冬梅，張秀明.血紅蛋白變異體對糖化血紅蛋白測定結果的干擾及處理［J］.中華檢驗醫學雜志，2014（37）：123-126.

［5］索艷，李強.糖化血紅蛋白測定方法及影響因素的研究進展［J］.醫學研究生學報，2010，23（2）：211-212．

［6］Goldstein DE，Little RR，Lorenz RA，Malone JI，Nathan D，Peterson CM：American Diabetes Association Technical Review on Tests of Glycemia.Diabetes Care，1995，18：896-909.

［7］Sundaram RC，Selvaraj N，Vijayan G etal：Increased plasma malondialdehyde and fructosamine in iron deficiency anemia：effect of treatment.Biomed Pharmacother，2007，（61）：682.

［8］蘇作軍.糖化血紅蛋白不同測定法的評價 ［J］.檢驗醫學，2004，19（6）：514-517.

Analysis of common problems in clinical application of D-10 Bio-Rad glycosylated hemoglobin analyzer

HAN Hong-mei，HOU Ming-liang
Department of clinical laboratory，the Third Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou Jiangsu 221003，China

Objective To summarize the common problems and results of D-10 A1c（HbA1c）analyzer in the detection process.Methods a retrospective analysis of the samples and their chromatographic column.Conclusion in the testing result of Bole D-10 glycosylated hemoglobin analyzer report to understand the interference factors of the instrument，carefully observed the column chart，to determine whether the presence of hemoglobin variants or other interference，combined with clinical provide more accurate interpretation of the results more comprehensive.

Glycosylated hemoglobin；D-10；Abnormal hemoglobin；Hemoglobin variants

R587.1

A

1672-4062（2015）12（b）-0127-03

10.16658/j.cnki.1672-4062.2015.24.127

2015-09-21）

韓紅梅（1977.11-），女，江蘇徐州人，主管檢驗師，本科，研究方向：餐后高血糖與心血管病的關系。