大腸桿菌溫敏耐熱系統的構建與應用

賈海洋，孫歡，孫翔英，馮旭東，李春,

?

大腸桿菌溫敏耐熱系統的構建與應用

賈海洋1，孫歡1，孫翔英2，馮旭東1，李春1,2

（1北京理工大學生命學院生物工程系，北京 100081；2石河子大學化學化工學院/兵團綠色化工過程重點實驗室，新疆石河子 832003）

發酵過程中熱脅迫不僅影響微生物的生長和生產，還因冷卻控溫增加了生產成本。通過人工設計合成的溫敏型RNA開關調控來源于騰沖嗜熱菌（MB4）的熱激蛋白DnaK的表達，該溫敏型耐熱系統顯著提高了大腸桿菌的耐熱性，同時還減少了大腸桿菌在37℃過表達熱激蛋白的代謝負荷。將該系統應用于產賴氨酸大腸桿菌的高溫發酵，不僅強化了其在40℃下的生長能力，而且顯著提高了其在高溫下的生產能力，賴氨酸產量比對照組提高了2.95倍。溫敏型耐熱系統的應用為人工耐熱生物系統的構建提供了新方法。

生物技術；合成生物學；發酵；耐熱性；RNA溫敏開關；熱激蛋白；賴氨酸

引 言

近年來，我國發酵產業顯示出強大的活力，尤其是在一些大宗生化產品的生產規模方面處于世界前列。然而，在發酵過程中，微生物會受到許多不利條件的限制，這些條件大多是由培養環境自身代謝或培養環境引起的[1]。以賴氨酸發酵為例，一方面賴氨酸生產屬于中溫發酵，發酵溫度一般控制在（37.0±0.5）℃。由于在發酵過程中微生物會因菌體生長和代謝而釋放大量熱能，發酵液溫度會隨之升高，嚴重影響菌體生長與目標代謝物的產率。另一方面，生產賴氨酸的原料、糖蜜以及玉米漿，需要經過同步糖化過程的處理（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）[2]。而糖化過程中的糖化酶的最適催化溫度為60℃，這個溫度遠高于一般賴氨酸生產菌株的生長溫度，因此糖化過程后，需要冷卻降溫，這也極大地增加了生產成本。如果能提高發酵菌株的耐熱性，將會為工業生產帶來大量優勢：（1）降低冷卻成本；（2）加速細胞代謝，提高細胞合成效率以及生產效率，縮短發酵周期；（3）加速傳質，使揮發性產品易于分離提取；（4）降低染菌風險[3-4]。因此，對發酵菌株進行耐熱改造對發酵行業的發展是至關重要的。

提高菌株的耐熱性有高溫馴化和分子改造等方法。但是傳統的高溫馴化及誘變方法周期長、工作量大、耗費人力物力，還可能會丟失部分優良性狀，而工業微生物發酵需要在保證不改變菌種優良性狀的基礎上快速高效地提高微生物的耐熱性。從分子層面上，國內外已有報道通過改變大腸桿菌自身的轉錄因子[5]或者引入外源熱激蛋白可以有效提高菌株耐熱性[6-8]。雖然熱激蛋白可以賦予微生物耐熱性，但是過量表達熱激蛋白會造成微生物的代謝負擔，影響細胞的生長與生產[9]。因此，需要構建更加高效、可控的微生物人工耐熱系統。近年來，合成生物學蓬勃發展。其將工程原理應用到生物學，旨在人工設計基因編碼的生物系統，增加生物的系統性、可預見性、魯棒性、可擴展性以及高效性[10-13]。合成生物學為高效生物系統的構建提供了高效強力的方法。

另外，微生物上萬年的自然進化，給了人們足夠的啟發，供人們去學習模擬。在應對環境溫度變化時，細菌可以利用復雜的策略來控制基因的表達[14]。許多編碼熱激蛋白和毒力因子的基因是由溫敏型非編碼RNA序列調控的，稱為RNA溫度計（RNA thermometers）[15]。RNA溫度計位于mRNA 5′非翻譯區，折疊形成二級莖環結構，同時隱藏了核糖體結合位點，當溫度較低時，RNA溫度計不打開，阻止核糖體與核糖體結合位點結合，從而阻止翻譯的進行，當溫度升高到一定值時，莖環結構打開，釋放核糖體結合位點，翻譯得以進行。天然的RNA溫度計主要有兩類。ROSE型 RNA溫度計包括2～4個獨立的莖環結構，3′端與SD序列互補的莖環結構只有在低溫下保持穩定。所以大部分ROSE型RNA溫度計在30℃下保持關閉，37℃處于未完全打開狀態，42℃完全打開[16-18]。FourU型RNA溫度計是由4個尿嘧啶和SD序列中的AGGA互補配對，通常包括兩個獨立的莖環結構，其中一個是熱穩定型的，另一個是熱敏感型的，30℃時為低翻譯水平，但是在45℃時完全開啟[19]。顯然，RNA溫度計提供了一個很好的利用溫度來誘導或抑制蛋白表達的工具。但是，大多數天然的RNA溫度計相對復雜，且響應溫度的范圍比較窄，難以滿足可控的調節熱激蛋白表達的目的。因此有必要設計相對簡單、更加方便的人工合成的RNA溫度計。

本文將利用合成生物學的方法，通過異源表達嗜熱微生物的耐熱基因來提高大腸桿菌的耐熱性。為了緩解在常溫下過量表達熱激蛋白對微生物帶來的負擔，通過借鑒RNA溫度計人工合成了響應一定溫度的RNA溫敏開關，用來調控熱激蛋白的表達，即特定高溫下大量表達，而在低溫下表達保持較低的表達水平，使得構建的微生物耐熱系統更加可控，從而緩解正常溫度下熱激蛋白的過表達給微生物帶來的負擔。同時，將由RNA溫敏開關和熱激蛋白構建的耐熱系統應用于賴氨酸高溫發酵，以提高微生物的生產效率。

1 材料和方法

1.1 菌株和質粒

TOP10，BL21（DE3）和pET-28a(+) 質粒購自北京博邁德生物技術有限公司。騰沖嗜熱菌基因組由中國科學院微生物研究所饋贈。pSB1C3、pSB1A3和 pSB1K3質粒來源于iGEM Distribute Kit。

1.2 試劑和培養基

質粒提取試劑盒購自北京博邁德生物技術有限公司。膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司（北京合成部）合成。Pfu DNA聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶為TaKaRa（大連）公司產品。IPTG、卡那霉素、氯霉素和氨芐青霉素購自Sigma公司。大腸桿菌LB培養基成分為：蛋白胨 10 g·L-1，酵母粉 5 g·L-1，氯化鈉 10 g·L-1。

1.3 RNA溫敏開關的人工合成與標準元器件的構建

人工合成的兩條寡聚核酸單鏈通過梯度退火的方式合成雙鏈DNA（體系：100 μl，100 pmol DNA；PCR程序：95℃變性3 min，每8 s降低0.1℃，最終降至25℃）。由于設計的RNA溫敏開關需要制作為標準元件（biobrick），因此RNA溫敏開關的序列兩端要加上制作標準元件的前綴（prefix，5′-GTT TCT TCG AAT TCG CGG CCG CTT CTA GA-3′）和后綴（suffix，5′-GTT TCT TCC TGC AGC GGC CGC TAC TAG TA-3′）。隨后將反應產物進行雙酶切（Ⅰ和Ⅰ），與pSB1C3載體連接轉化，菌落PCR篩選陽性菌落。篩選得到的陽性菌落提取的質粒即為標準元件，可用于3A-assembly[19]。

1.4 RNA溫度的表征——蛋白質電泳與熒光強度檢測

過夜培養含有紅色熒光蛋白基因的大腸桿菌種子液，按照1:100的比例接種于新鮮的100 ml液體LB培養基中，170 r·min-1，分別于33、37、40、43℃培養，12 h取樣。分別利用SDS-PAGE蛋白電泳定性初步分析各溫度下的蛋白表達情況。為了探究紅色熒光蛋白在各溫度下的作用，拓寬了檢測溫度，用流式細胞儀進一步對30、33、37、40、43℃下熒光強度進行分析（emission: 607，excitation: 584）。用流式細胞儀檢測熒光強度時，系統會自動計算生成實驗組的峰圖以及熒光強度。

1.5 恒定高溫培養

過夜培養的種子液按1:100接種至300 ml新鮮LB培養基中，37℃培養至OD600為1.0左右，菌液一式三份，分別置于40、43、46℃高溫培養，開始每隔4 h取一次樣，培養12 h后，每隔12 h取樣，共培養51 h，以OD600值和點滴平板法表征大腸桿菌耐熱性。每個實驗組重復3次。

1.6 高溫賴氨酸發酵

過夜培養的種子液按1:100接種至48孔板中，在Biolector（m2p-labs，1000 r·min-1）40℃下培養48 h。發酵過程中每隔2 h用5%氨水調節pH至7.0。發酵過程中，每6 h取樣，發酵液12000 r·min-1離心2 min，將上清液用水稀釋至小于100 mg·ml-1。用SBA-40C生物傳感分析儀測量賴氨酸濃度。每個實驗組重復3次。

2 結果與討論

2.1 人工合成RNA溫敏開關的設計

借鑒天然RNA溫度計的結構，人工合成RNA溫敏開關(RNA temperature sensitive switch，RNAT)的結構主要由SD序列（5′-AAGGAG-3′）、ASD（anti-SD，反義SD序列）以及之間的環狀結構構成[圖 1 (a)]。可以通過The mfold Web Server預測和計算RNA溫敏開關二級結構以及自由能。RNA溫敏開關自由能大小的調整可以通過改變莖環序列堿基匹配程度，G-C含量以及環狀結構的大小來實現。為方便元件之間的組裝，人工設計的RNA溫敏開關需要設計成標準元件，但是在通過3A-assembly方法組裝基因時，相鄰兩個基因之間產生的間隔區存在互補序列。因此單純地模擬RNA溫敏開關的原有序列不能很好地預測RNA溫敏開關的打開溫度，所以在模擬和設計RNA溫敏開關的結構和自由能時，需要在RNA溫敏開關的序列中包含3A-assembly組裝方法產生兩個間隔區。根據The mfold Web Server提供的計算方法，本研究成功設計并人工合成一個RNA溫敏開關。兩條寡聚合甘酸序列為RNAT-S-5′-CGAATTCTTCTAGA GCTCCTTAAAAAAAAAAAGTACTAAGGAGTACTAGTACTGCAGGA-3′，RNAT-AS-5′-TCCTGCAGT ACTAGTACTCCTTAGTACTTTTTTTTTTTAAG GAGCTCTAGAAGAATTCG-3′。轉錄后得到的RNA序列為：5′-UACUAGAGCUCCUUA AAAAAAAAA AGUACUAAGGAGUACUAG-3′。用The mfold Web Server模擬得到的結構如圖1 (c)所示，其自由能為Initial Δ-13.10 kcal·mol-1。為了驗證RNA溫敏開關功能，通過3A-assembly，將RNA溫敏開關標準元件和無SD序列的啟動子J23119以及紅色熒光蛋白（RFP，E1010）通過3A-assembly在大腸桿菌中構建了報告基因表達盒[圖1 (b)]，所得菌株（J23119- RNAT-E1010）可用于熒光檢測和蛋白質電泳分析。

圖1 合成RNA溫敏開關的設計與構建

2.2 人工合成RNA溫敏開關的表征

為檢測RNA溫敏開關的感應溫度同時驗證人工設計的RNA開關是否可以正常工作，利用SDS-PAGE（定性）以及流式細胞儀（定量）測試所構建的菌株J23119-RNAT-E1010在不同溫度下紅色熒光蛋白的表達情況。首先，SDS-PAGE結果表明在不同溫度下，紅色熒光蛋白（27.6×103）在大腸桿菌體內有不同程度的表達[圖 2 (a)]。然后利用流式細胞儀定量檢測紅色熒光蛋白表達水平，結果顯示RNA溫敏開關調控的紅色熒光蛋白在≤ 37℃下有微量的本底表達，并且隨著溫度升高紅色熒光蛋白熒光強度也相應地提高，說明RNA溫敏開關隨著溫度的升高，莖環結構逐漸打開，對SD序列的阻遏逐漸減小，43℃的熒光強度是33℃的7.3倍[圖 2 (b)]。另外，流式細胞儀的原始數據顯示，隨著溫度的升高，越來越多的工程菌株在37～40℃之間從陰性轉變為陽性[圖 2 (c)]。以上結果顯示，人工設計的RNA開關可以對溫度的變化做出動態響應，以此來調控蛋白質的翻譯過程。因此，該RNA溫敏開關可以用于后續溫敏系統的構建。

圖2 RNAT功能性表征結果

2.3 溫敏耐熱系統的構建與表征

已有研究表明引入騰沖嗜熱菌的耐熱基因可以有效提高大腸桿菌的耐熱性[7,20]。本研究將從騰沖嗜熱菌種成功擴增到的熱激蛋白基因應用于大腸桿菌耐熱性改造。DnaK是廣泛存在于生物體內起分子伴侶功能的熱激蛋白，可以通過DanK-DnaJ系統幫助非天然構象的蛋白和新生肽鏈正確折疊并維持其結構和功能，從而幫助生物抵抗熱脅迫[21-22]。將擴增得到的基因在大腸桿菌中表達，SDS-PAGE結果顯示，30℃條件下誘導，該熱激蛋白DnaK可以在大腸桿菌正常表達，并且全部以可溶形式存在（圖3）。DnaK為分子伴侶，也有利于其可溶性表達。為了驗證DnaK是否可以提高大腸桿菌耐熱性，本文設計了恒定高溫（40、43和46℃）實驗，結果如圖4所示。由圖可知在3個溫度下工程菌比對照均表現出良好的生長優勢。40℃時，工程菌顯示出較快的生長速率，OD600值比對照組有大幅提升（2倍）。而且對照在15 h后開始下降，工程菌一直在緩慢升高直至平緩。當溫度提升至43℃后，工程菌的生長情況也優于對照組（1.8倍）。整體來看，雖然隨著溫度的上升，菌株的生長情況變差，且當溫度升至46℃后，工程菌的OD600最大值只有2.9，但是其生長狀況仍然優于對照菌，是對照組的1.5倍。以上結果顯示，來自騰沖嗜熱菌的DnaK可以有效地提高大腸桿菌耐熱性。

圖3 SDS-PAGE分析熱激蛋白DnaK在30℃下的誘導表達情況

M—protein marker; lane 1—negative control (no inducer added); lane 2—whole cell; lane 3—cell lysis; lane 4— precipitation

圖4 耐熱工程菌BL21-DanK與對照的生長曲線

將獲得的RNA溫敏開關與DnaK組裝，即獲得對溫度敏感的大腸桿菌耐熱系統。為驗證RNA溫敏開關對蛋白表達的調控對微生物生長的益處，本文驗證了在正常溫度（37℃）下，過量表達DnaK以及由RNA溫敏開關調控表達這兩種情況對細胞生長的影響（圖 5），結果表明由RNA溫敏開關控制菌株的生長情況優于過量表達DnaK的菌株。由于DnaK（70×103）分子量較大，過量表達會對細胞造成負擔，用RNA溫敏開關對DnaK的表達進行調控，緩解DnaK在正常溫度下的過表達給細胞帶來的負荷，從而使細胞生長狀況更優。

圖5 37℃下溫敏型耐熱系統對大腸桿菌生長的影響

2.4 溫敏耐熱系統在賴氨酸高溫發酵中的應用

將構建的溫敏耐熱系統應用于賴氨酸高溫發酵。在40℃下發酵48 h，每6 h測量賴氨酸產量，所得結果如圖6所示。菌株DanK-Lys在40℃下的生長能力（Biolector監測的biomass作為生長指標）比對照有了顯著提高[圖6 (b)]，同時其賴氨酸產量也有大幅提高，是對照組的2.95倍，實驗室最高產量為8.47 g·L-1，極大地提高了高溫下生產能力[圖6 (a)]。盡管產量還沒有達到目前37℃下的水平，但是本研究對于高溫賴氨酸發酵，邁出了堅實的一步。

圖6 40℃下DnaK-Lys和對照的賴氨酸發酵

3 結 論

本研究人工設計了對溫度響應的RNA溫敏開關，將熱激蛋白（DnaK）與RNA溫敏開關進行理性組裝并與大腸桿菌集成，構建了溫敏型耐熱系統，緩解了大腸桿菌在37℃時的生長負荷，大幅度提高其耐熱性，并將溫敏型耐熱系統應用于賴氨酸高溫發酵，其在40℃的生產能力有了顯著提高。主要結論如下。

（1）通過軟件模擬，人工設計合成了RNA溫敏開關，能響應溫度變化，調控蛋白在特定溫度下的表達。RNA溫敏開關調控的紅色熒光蛋白表達隨溫度的升高其熒光強度增強。

（2）源于嗜熱菌的熱激蛋白DnaK，可以在大腸桿菌體內全部以可溶性形式表達，并且在40、43、46℃下大幅提高了大腸桿菌的耐熱性。

（3）通過溫度敏感的RNA溫敏開關，調控熱激蛋白DnaK的表達，構建了溫敏型耐熱系統，緩解了在37℃下DnaK的過量表達對大腸桿菌的代謝負荷。將溫敏型耐熱系統應用于賴氨酸高溫發酵，在40℃下，賴氨酸產量提高了2.95倍。溫敏型耐熱系統可以有效提高高溫生產能力。

References

[1] Walker Graeme M, van Dijck P. Physiological and molecular responses of yeasts to the environment//Yeasts in Food and Beverages [M]. Berlin: Springer, 2006: 111-152.

[2] Rivas B, Moldes A B, Domínguez J M, Parajó J C. Lactic acid production from corn cobs by simultaneous saccharification and fermentation: a mathematical interpretation [J]., 2004, 34 (7): 627-634.

[3] Abdel-Banat B M, Hoshida H, Ano A, Nonklang S, Akada R. High-temperature fermentation: how can processes for ethanol production at high temperatures become superior to the traditional process using mesophilic yeast [J]., 2010, 85 (4): 861-867.

[4] Zeikus J. Thermophilic bacteria: ecology, physiology and technology [J]., 1979, 1 (4): 243-252.

[5] Christ D, Chin J W. Engineeringheat-resistance by synthetic gene amplification [J]., 2008, 21 (2): 121-125.

[6] Liu Y, Zhang G, Sun H, Sun X, Jiang N, Rasool A, Lin Z, Li C. Enhanced pathway efficiency ofby introducing thermo-tolerant devices [J]., 2014, 170: 38-44.

[7] Luan G, Dong H, Zhang T, Lin Z, Zhang Y, Li Y, Cai Z. Engineering cellular robustness of microbes by introducing the GroESL chaperonins from extremophilic bacteria [J]., 2014, 178: 38-40.

[8] Ezemaduka A N, Yu J, Shi X, Zhang K, Yin C C, Fu X, Chang Z. A small heat shock protein enablesto grow at a lethal temperature of 50℃ conceivably by maintaining cell envelope integrity [J]., 2014,196 (11): 2004-2011.

[9] Shenhar Y, Rasouly A, Biran D, Eliora Z Ron. Adaptation ofto elevated temperatures involves a change in stability of heat shock gene transcripts [J]., 2009, 11 (12): 2989-2997.

[10] Wang Y H, Wei K Y, Smolke C D. Synthetic biology: advancing the design of diverse genetic systems [J]., 2013, 4: 69-102.

[11] Khalil A S, Collins J J. Synthetic biology: applications come of age [J]., 2010, 11 (5): 367-379.

[12] Benner S A, Sismour A M. Synthetic biology [J]., 2005, 6 (7): 533-543.

[13] Purnick P E, Weiss R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems [J]., 2009, 10 (6): 410-422.

[14] Smoot L M, Smoot J C, Graham M R, Somerville G A, Sturdevant D E, Migliaccio C A, Sylva G L, Musser J M. Global differential gene expression in response to growth temperature alteration in group A[J]., 2001, 98 (18): 10416-10421.

[15] Kortmann J, Narberhaus F. Bacterial RNA thermometers: molecular zippers and switches [J]., 2012, 10 (4): 255-265.

[16] Nocker A, Hausherr T, Balsiger S, Krstulovic N P, Hennecke H, Narberhaus F. A mRNA-based thermosensor controls expression of rhizobial heat shock genes [J]., 2001, 29 (23): 4800-4807.

[17] Waldminghaus T, Gaubig L C, Klinkert B, Narberhaus F. Thethermometer is comprised of stable and unstable structural elements [J]., 2009, 6 (4): 455-463.

[18] Chowdhury S, Ragaz C, Kreuger E, Narberhaus F. Temperature- controlled structural alterations of an RNA thermometer[J]., 2003, 278 (48): 47915-47921.

[19] Waldminghaus T, Heidrich N, Brantl S, Narberhaus F. FourU: a novel type of RNA thermometer in[J]., 2007, 65 (2): 413-424.

[20] Sun Xiangying (孫翔英), Liu Yueqin (劉月芹), Sun Huan (孫歡), Jia Haiyang (賈海洋), Dai Dazhang (戴大章), Li Chun (李春). Construction of heat resistance devices forand their application [J].(化工學報), 2014, 65 (8): 3128-3135.

[21] Langer T, Lu C, Echols H, Flanagan J, Hayer M K, Hartl F U. Successive action of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of chaperone-mediated protein folding [J]., 1992, 356 (6371): 683-689.

[22] Schr?der H, Langer T, Hartl F, Bukau B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage [J]., 1993, 12 (11): 4137.

Construction and application of temperature sensitive thermotolerant system in

JIA Haiyang1, SUN Huan1, SUN Xiangying2, FENG Xudong1, LI Chun1,2

(1School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;2Key Laboratory for Green Processing of Chemical Engineering of Xinjiang Bingtuan, School of Chemistry and Chemical Engineering, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang, China)

The heat stress produced in fermentation process can not only affect the growth and reproduction of microorganisms, but also increases production cost from cooling and temperature control. The improvement of strain thermotolerance is highly desire for fermentation industry, which could significantly go up productivity and reduce production cost. So in this study, an artificial design and synthesis RNA switch with temperature sensitivity is employed to regulate and control the heat shock protein Dnak fromMB4, which leads to the thermotolerance improvement of. This improvement not only alleviated the burden of overexpressing heat shock protein inat 37℃, but also enhanced its productivity at high temperature. The results of application test show that at 40℃ the output of lysine produced by.increases by 2.95 folds, when compared with control group. This success could be twilight for the development of new method to prepare thermotalerance microorganisms.

biotechnology; synthetic biology; fermentation; thermotolerance; temperature sensitive RNA switch; heat shock protein; lysine

2014-12-29.

supported by the National Basic Research Program of China (2011CBA00800), the National Natural Science Foundation of China (21376028) and the National Science Fund for Distinguished Youth Scholars of China (21425624).

Prof. LI Chun, lichun@bit.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20141929

Q 789

A

0438—1157（2015）07—2613—07

國家重點基礎研究發展計劃項目（2011CBA00800）；國家自然科學基金項目（21376028）；國家杰出青年科學基金項目（21425624）。

2014-12-29收到初稿，2015-03-24收到修改稿。

聯系人：李春。第一作者：賈海洋（1988—），男，碩士研究生。