不同部位獨(dú)一味的NMR代謝組模式識(shí)別研究

潘 正， 毛 慶， 江 生， 范 剛， 張 藝

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族藥學(xué)院，四川　成都　611130；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶　401121）

不同部位獨(dú)一味的NMR代謝組模式識(shí)別研究

潘 正1， 毛 慶2， 江 生2， 范 剛1， 張 藝1

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族藥學(xué)院，四川成都611130；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶401121）

目的 運(yùn)用1H-NMR代謝組學(xué)方法研究藏藥獨(dú)一味地上部分與地下部分的化學(xué)成分差異。方法 獨(dú)一味加入CD3OD后超聲提取，將1H-NMR測定的信息進(jìn)行主成分分析（PCA）和PLS-DA法分析。結(jié)果 數(shù)據(jù)分析表明獨(dú)一味地下部分的代謝產(chǎn)物中葡萄糖、蔗糖、果糖的含有量高于地上部分，而脂肪酸低于地上部分。結(jié)論 獨(dú)一味的PCA載荷圖中部分的信號(hào)仍然難以歸屬，須進(jìn)一步結(jié)合MS圖譜進(jìn)行分析。

1H-NMR；獨(dú)一味；地上部分；地下部分；葡萄糖；蔗糖；果糖；脂肪酸；主成分分析

唇形科獨(dú)一味屬植物獨(dú)一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo，生長于海拔3 000 m以上的高山草原、碎石灘中，原是藏醫(yī)藥學(xué)臨床常用藥材，別名達(dá)布巴、達(dá)巴巴、吉布孜等，自《中國藥典》1995年版［1］收錄其制劑以來，以其良好的止血鎮(zhèn)痛效果，迅速成為次于云南白藥，年產(chǎn)值超億元的中成藥品種。2005年，獨(dú)一味全草作為藥材首次收錄于《中國藥典》［2］，在此以前，獨(dú)一味主要以地下部分入藥，由于僅采挖地下部分破壞高原草地植被，為了更好地利用資源，將全草收錄為藥材，即便如此，采挖地下部分對(duì)高原草地生態(tài)環(huán)境的破壞，長時(shí)間難以恢復(fù)，因此《中國藥典》2010年版［3］將獨(dú)一味的干燥地上部分列為藥用部位，基本禁止采挖地下部分。

但不同的藥用部位其化學(xué)成分組成和藥理活性不同，迄今為止，獨(dú)一味藥材地上部分與地下部分的化學(xué)成分組成差異未見報(bào)道。為了全面反映兩個(gè)不同部位化學(xué)成分組成差異，采集西藏、四川、甘肅等12個(gè)產(chǎn)地獨(dú)一味樣本，對(duì)其不同部位提取物進(jìn)行1H-NMR譜研究，通過化學(xué)模式識(shí)別法進(jìn)行主成分分析［4-6］，尋找獨(dú)一味不同部位之間的相似性和差異性，為獨(dú)一味開發(fā)應(yīng)用等研究提供理論依據(jù)。

1　儀器與試藥

Varian Mercury Plus 400 MHz核磁共振波譜儀（美國Varian公司，第三軍醫(yī)大學(xué)-重慶化醫(yī)集團(tuán)控股聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室）；Sartorius BP221S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有效公司）；KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；氘代甲醇（CD3OD，99.8%）、重水（D2O，99.9%）均購自北京京云重輕科技有限公司，3-三甲基甲硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉（TSP，美國Sigma-Aldrich公司）。

本實(shí)驗(yàn)所用藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝教授鑒定為唇形科獨(dú)一味屬植物獨(dú)一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo.的干燥全草。

2　方法

2.1供試液的制備 取獨(dú)一味地上部分和地下部分，粉碎至60目。精密稱取約100.0 mg，分別置于2 mL EP管中，分別加入0.8 mL CD3OD，超聲提取30 min，離心，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至核磁管中，備用。

2.21H-NMR測定及圖譜處理［7-8］在25℃、35%環(huán)境濕度，采用標(biāo)準(zhǔn)脈沖程序采集圖譜，進(jìn)行基線校正和相位校正。質(zhì)子觀察頻率400.64 MHz，譜寬6 410.3 Hz，弛豫時(shí)間為2 s，掃描次數(shù)64，采集時(shí)間為2.556 s，調(diào)用水峰壓制序列壓制水峰信號(hào)，總測定時(shí)間為6 min 54 s。將核磁文件導(dǎo)入MestReNova軟件，調(diào)整基線后，從δ8.00～0.00以0.04為間隔進(jìn)行積分，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最后去掉CD3OD溶劑峰和水峰數(shù)據(jù)，生成一個(gè)24×187的矩陣，矩陣的列代表不同的樣品。

2.3數(shù)據(jù)分析 將數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果通過SIMCA-P 11.5進(jìn)行多維數(shù)據(jù)的分析。數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計(jì)分析采用主成分分析（PCA）方法進(jìn)行模式識(shí)別。建立模型后，分別產(chǎn)生得分矩陣圖和載荷矩陣圖，通過得分矩陣圖來獲得各組數(shù)據(jù)的分型信息。而載荷矩陣圖能反映各個(gè)變量對(duì)樣品分型的影響。

采用偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）［9］法進(jìn)行模式識(shí)別。

3　結(jié)果與討論

3.1不同部位化學(xué)成分PCA分析 為了區(qū)分獨(dú)一味不同部位化學(xué)成分的差異、找到獨(dú)一味地上部分代替地下部分使用的理論依據(jù)，采用了PCA模式識(shí)別技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析，所得PCA得分圖見圖1，結(jié)果表明，前2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到94.7%，說明這2個(gè)主成分已經(jīng)可以對(duì)94.7%以上的原變量信息進(jìn)行解釋，故選取這2個(gè)主成分進(jìn)行得分圖和載荷圖的分析。根據(jù)圖中兩組樣本的空間投影距離和混雜程度來看，獨(dú)一味地上部分與地下部分代謝產(chǎn)物在PC1軸上均存在顯著差別，而在PC2軸上差異不大。

圖1　獨(dú)一味藥材不同部位1H-NMR的PCA分析得分Fig.1 PCA score p lot in different parts of Lamiophlomis rotata

圖2　獨(dú)一味藥材不同部位1H-NMR的PCA分析載荷圖Fig.2 PCA loading p lot in different parts of Lam iophlom is rotata

為了區(qū)分這些不同部位的代謝產(chǎn)物，采用PCA載荷圖進(jìn)行篩查分析。根據(jù)載荷圖（圖2）對(duì)差異性代謝成分進(jìn)行指認(rèn)，發(fā)現(xiàn)主要為初生代謝產(chǎn)物信號(hào)，葡萄糖的信號(hào)峰δ3.78（α-anomer）、3.62、3.46，蔗糖的H-1信號(hào)峰δ5.42（H，d，J=3.8 Hz），果糖的H-3信號(hào)峰δ4.14（H，d，J=8.6 Hz），脂肪酸的信號(hào)峰δ1.31（br.s）。結(jié)果顯示獨(dú)一味地上地下部位化學(xué)成分差異主要表現(xiàn)為，地下部分的代謝產(chǎn)物中葡萄糖、蔗糖、果糖的量高于地上部分，而脂肪酸低于地上部分。地下部分為植物的營養(yǎng)器官，貯藏的糖類物質(zhì)較多，地上部分為植物的莖葉、花序及種子等，具有生長運(yùn)輸養(yǎng)料和生殖繁殖功能，因此含有的脂肪酸含量較高。

前期研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)一味中次生代謝產(chǎn)物1H-NMR的指紋區(qū)域主要集中在δ7.80～4.00，對(duì)該區(qū)域篩查分析，發(fā)現(xiàn)與PC1正相關(guān)的還有δ7.59、6.69、6.61、4.91、4.74、4.34，與PC1負(fù)相關(guān)的主要有δ7.56、7.45、6.65、5.34、5.14和4.51。結(jié)合前期研究，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行信號(hào)歸屬，從中發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷中咖啡酰基質(zhì)子信號(hào)δ7.59，以及苯環(huán)質(zhì)子信號(hào)δ6.69、6.61；δ7.56和7.45分別為胡麻屬苷和8-O-乙酰山梔苷甲酯的H-3質(zhì)子信號(hào)。雖然上述信號(hào)與葡萄糖、蔗糖、果糖和脂肪酸等化合物信號(hào)相比，在整個(gè)載荷圖中幾乎可以忽略不計(jì)，但上述信號(hào)的分析，對(duì)考察藥材中次生代謝產(chǎn)物差異有重要意義，研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)一味地上地下部位次生代謝產(chǎn)物差異主要表現(xiàn)為，地下部分的毛蕊花糖苷含量高于地上部分，而胡麻屬苷和8-O-乙酰山梔苷甲酯低于地上部分。

PCA為無監(jiān)督的分析方法，反映了數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，用來觀察實(shí)驗(yàn)樣品的自然分布和組別關(guān)系。進(jìn)一步區(qū)分不同組別差異，將組內(nèi)的差異降至最低，更能把握多維數(shù)據(jù)的整體特征和變異規(guī)律，采用有監(jiān)督的PLS-DA分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［10-11］。

3.2PLS-DA分析 在樣品的PLS-DA統(tǒng)計(jì)分析載荷圖（圖3）中，各個(gè)成分距離原點(diǎn)的距離表明了其對(duì)判別貢獻(xiàn)的大小，距原點(diǎn)越遠(yuǎn)，對(duì)樣品分類的貢獻(xiàn)越大，即潛在的代謝標(biāo)記物。在作為變量的色譜峰中，δ3.78、3.82、3.74、3.62、1.31、1.35、1.11、4.11各峰距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，對(duì)樣品分類貢獻(xiàn)較大，與PCA分析結(jié)果趨勢相符。

4　結(jié)論

本研究以1H-NMR為識(shí)別變量，運(yùn)用PCA和PLS-DA方法對(duì)不同部位的獨(dú)一味樣品進(jìn)行分析，均可實(shí)現(xiàn)獨(dú)一味的部位分類。從代謝組整體化學(xué)信息來看，地上部分與地下部分獨(dú)一味藥材間的差異客觀存在，植物中初生代謝產(chǎn)物如葡萄糖、蔗糖、果糖在獨(dú)一味地下部位中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，而脂肪酸在獨(dú)一味地上部位中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。通過對(duì)獨(dú)一味地上地下部位1H-NMR光譜的PCA和PLS-DA分析，結(jié)果提示，獨(dú)一味不同部位的化學(xué)成分組成主要表現(xiàn)為初生代謝產(chǎn)物的差異，為獨(dú)一味地上部位代替地下部位入藥提供了初步的理論支持。

圖3　獨(dú)一味藥材1H-NMR的PLS-DA載荷圖Fig.3 PLS-DA loading p lot in different parts of Lam iophlom is rotata

獨(dú)一味中含有的次生代謝產(chǎn)物［12-13］如環(huán)烯醚萜、黃酮、苯乙醇苷等在不同的部位肯定存在差異，但在PCA載荷圖譜中相應(yīng)區(qū)域信號(hào)對(duì)樣品分類貢獻(xiàn)很小，雖然發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷、胡麻屬苷和8-O-乙酰山梔苷甲酯等成分在藥材地上地下部位含量存在差異，其可靠性仍需結(jié)合其他分析方法進(jìn)一步驗(yàn)證；此外，前期雖然對(duì)獨(dú)一味地上部分的8個(gè)次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了1H-NMR信號(hào)歸屬（已整理，另文發(fā)表），但對(duì)于PCA載荷圖中δ6.65、5.34、5.14、4.91、4.74、4.51和4.34的信號(hào)仍然難以歸屬，下一步課題組將針對(duì)上述問題，擬結(jié)合HPLC和MS指紋圖譜綜合分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其差異性成分，對(duì)獨(dú)一味的代謝產(chǎn)物差異進(jìn)行更為全面的研究。

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M etabonom ics and pattern recognition study on the different parts of Lamiophlom is rotata（Benth.）Kudo

PAN Zheng1， MAO Qing2， JIANG Sheng2， FAN Gong1， ZHANG Yi1
（1.College of Ethnic Medicine，Chengdu Uniυersity of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611130，China；2.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China）

AIM To study the distribution characteristics of components from above-and underground parts of Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo.METHODS The powdered materialswere extracted with CD3OD under ultrasonication.Principal componentanalysis（PCA）and partial least squares discriminantanalysis（PLS-DA）were applied to the analysis of the1H-NMR spectroscopy data of L.rotata.RESULTS The experimental results showed that the levels of glucose，fructose，sucrose in underground parts were much higher than these in aboveground parts.In contrast，the fatty acid level of underground parts was lower than that of above-ground ones. CONCLUSION The loading plot shows that some signals of L.Rotata are difficult to classify and further study combined with MS spectra is necessary.

1H-NMR；Lamiophlomis rotata；above-part；underground part；glucose；fructose；sucrose；fatty acid；principal component analysis（PCA）

R284.1

A

1001-1528（2015）03-0567-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.023

2014-05-26

重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（CSTC2014jcyjA10004）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KJ1400433）

潘 正（1976—），男，博士生，副教授，從事中藥化學(xué)成分分析。Tel：（023）62460536，E-mail：panzhengbusiness@ aliyun.com