蓮分子生物學研究進展

王劍雄　鄭興飛　刁英　胡中立

蓮分子生物學研究進展

王劍雄鄭興飛刁英胡中立

柯衛東 男，武漢市蔬菜科學研究所副所長兼水生蔬菜研究室主任，推廣研究員，享受國務院政府特殊津貼，水生蔬菜行業計劃及“十二五”國家科技支撐計劃首席專家，主持國家及省、市重大科研項目多項，《植物遺傳資源學報》、《長江蔬菜》編委。長期從事水生蔬菜種質資源及育種研究，在水生蔬菜種質資源保護及創新、新品種選育、微型種苗繁殖技術研究與應用等方面有創造性貢獻，有力推動了我國水生蔬菜學科建設及產業發展。發表論文、論著100余篇（部），制定農業行業標準9部，取得國家發明專利3項，獲國家科技進步獎二等獎、第四屆全國杰出專業技術人才獎等。

蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.）屬于蓮科（Nelumbonaceae）蓮屬（Nelumbo Adans），多年生水生宿根草本植物。蓮屬植物僅包含2個種：中國蓮（N.nuciferaGaertn.）和美洲黃蓮（N.luteaPers.）。中國是蓮的起源中心之一，也是蓮最大的栽培地，蓮在我國栽培有著悠久的歷史。根據形態和利用部位，蓮被分為子蓮、花蓮和藕蓮3個類型。蓮的用途極廣泛，其地下莖稱藕，能食用，葉可入藥，蓮籽為上乘補品，花可供觀賞。在我國，蓮作為一種重要的水生蔬菜，在生長發育、遺傳育種、組培快繁、品種分類等方面已進行了大量且深入的研究。近些年來，很多學者運用分子生物學技術開展了蓮的品質鑒定、遺傳多樣性研究、基因克隆及功能分析等方面的工作，對深入研究蓮的生長發育、新陳代謝，以及蓮種質資源的保護、發掘和利用提供了分子生物學基礎。

1　蓮DNA分子標記技術

分子標記是以個體間核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。分子標記具有快速、準確、多態性高、重現性好等優點，應用時能不受環境、組織部位和其他因素的影響。隨著分子生物學及其相關技術的發展，各種DNA分子標記技術被應用于蓮的親緣關系分析、品種鑒定、遺傳育種研究及遺傳圖譜構建中［1］；主要包括RAPD（Random amplified polymorphic DNA）、AFLP（Amplified fragment length poly-morphism）、SSR（Simple sequence repeats）和ISSR（Inter simple sequence repeats）等［2，3］。

RAPD標記是早期蓮應用中最廣泛的一種分子標記。郭宏波等［4～6］在2004年利用RAPD技術對32份蓮品種進行了遺傳多樣性研究，擴增形成的207條譜帶中多態帶有193條，占93.23%，顯示該屬植物在我國具有豐富的遺傳多樣性，且有十分明顯的遺傳分化。之后，又對野生蓮和千瓣蓮資源進行了多態性分析，結果均表現出豐富的遺傳多樣性。An等［7］在2009年采用RAPD技術對我國18個省的94份蓮材料進行種群遺傳結構分析，結果表明蓮具有豐富的遺傳多樣性，多態性位點百分率為67.15%。但RAPD技術在使用的過程中極易受到各種因素的影響，例如基因組DNA的復雜度、DNA模板的濃度和質量、PCR反應的循環次數等，限制了其推廣和使用。

與RAPD相比，SSR標記具有共顯性、多態性高、特異性強等優點，現在已經作為理想的分子標記廣泛地應用于現代分子生物學的相關領域。Pan等［8，9］在2007年開發了11對蓮SSR引物，在32個蓮品種中擴增出42條多態性條帶。隨后，利用蓮的EST序列開發了23個ESTSSR標記，對39個栽培中國蓮、10個野生蓮及1個美國蓮進行了遺傳多樣性分析。全志武等［10］在2008年開發了16對蓮基因組SSR引物，對10個藕蓮推廣品種進行了擴增驗證，其中6對引物共擴增出15條多態性條帶，并繪制了10個品種SSR指紋圖譜。日本學者Nakao等［11］在2009年用11對SSR引物對16個中國蓮品種進行PCR擴增，共擴增出43條多態性條帶，可有效地鑒別這些蓮品種，同時發現這11對SSR引物也可以有效地鑒別美國蓮和中美雜交蓮品種。Liu等［12］在2012年為了評估11份中國蓮的遺傳多樣性和親緣關系，開發了11對SSR引物，擴增出41條多態性條帶，并用這些SSR引物對71份來自世界各地具有高度遺傳多樣性的蓮品種成功地進行了聚類分析。最近，Yang［13］、Zhang Wei［14］、Li［15］等分別針對美國蓮和中國蓮開發了SSR引物，為蓮的分子鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構建、分子標記輔助育種等方面提供幫助。

ISSR是一種建立于微衛星DNA基礎之上的分子標記，其開發成本低、轉化率高、多態性高等特點，使得ISSR標記已廣泛應用于植物品種鑒定、基因定位、遺傳作圖、進化及分子生態學研究中。Han等［16～18］在2007年用基因組中ISSR標記分析了華中地區野生蓮遺傳變異和克隆多樣性，利用核糖體ITS、ISSR和RAPD標記分析了38個蓮品種的遺傳關系。2009年又用ISSR標記對湖北梁子湖的240個蓮個體進行了異交率和遺傳多樣性分析。Tian等［19］在2008年利用ISSR標記分析了蓮遺傳多樣性和親緣關系。李長春等［20］在2011年用8個ISSR分子標記引物對39份蓮藕品種進行遺傳多樣性分析，共擴增出89條帶，其中有55條多態帶，多態性比率平均為61.8%。通過遺傳相似系數和聚類分析，能將39份藕蓮品種完全區分開，說明ISSR標記技術能較好地從分子水平揭示出蓮藕品種的遺傳多樣性。

此外，楊美等［21］在2011年利用AFLP分子標記，對395份花蓮原始種質構建花蓮核心種質資源，以加強對花蓮種質資源的保存、研究和利用。You等［22］在2013年利用葉綠體DNAatpB-rbcL區序列和AFLP標記對120個蓮個體進行了遺傳關系分析，進一步研究了野生蓮和栽培蓮的遺傳關系。Hu等［23］在2012年用AFLP和SSR標記對58份蓮材料進行遺傳多樣性和親緣關系分析，以提高育種效率和加強種質資源的保護。

2　蓮功能基因的研究

植物生長在自然環境中極易受到各種環境因素脅迫的負面影響。近年來，隨著自然災害和人類生活影響的不斷擴大，已影響到蓮藕栽培品質和產量［24］，所以，近些年蓮的耐脅迫相關基因的研究相對比較集中。超氧化物歧化酶（SOD）在植物中普遍存在，SOD能夠增強植物在逆境中抵抗活性氧脅迫的能力。朱虹琳等［25］、Dong等［26］對蓮銅鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）基因進行了克隆和序列分析。董臣等［26～29］在2010年克隆了蓮抗氧化相關的四個基因：MnSOD、CuZnSOD、APX和CAT，研究表明蓮抗氧化基因在面對短期脅迫時具有協同作用。李國林等［30］2010年采用SMART技術成功構建了藕蓮和花蓮頂芽的cDNA文庫，為蓮相關功能基因的克隆提供了序列資源。同時克隆并分析了NnGPXl和蓮泛素轉運酶 NnUBC，對蓮進行冷、熱、機械損傷、高鹽、ABA、PEG等不同時間梯度的脅迫處理，發現NnGPXl和NnUBC表達水平在各種處理后都迅速升高，說明其在蓮生長發育和面對脅迫環境時起著重要的調節作用。Diao等［31］在2014年克隆了蓮谷胱甘肽過氧化酶（NnGPX）基因，并證明了蓮谷胱甘肽過氧化酶具有耐鹽性。除了以上這些脅迫相關基因以外，還有蓮種子防御素基因、蓮小分子熱激蛋白基因sHSP17.5、多酚氧化酶基因和CBF2基因已經被克隆［32～36］，且均被證明和蓮的抗逆性和脅迫相關。以上關于蓮抗逆性和脅迫相關基因的研究對提高蓮在脅迫環境中的生命力有一定的促進作用。

除了脅迫相關基因以外，與蓮淀粉合成相關的基因研究是當下學者研究的重點。以淀粉為主的碳水化合物是影響蓮產量和加工品質的主要因素，所以研究蓮淀粉相關基因對蓮產量和蓮產品的加工都具有一定的幫助。Lu等［37］在2012年從蓮品種“美人紅”中克隆了調控直鏈淀粉合成的顆粒結合淀粉合成酶 （Granule-bound starch synthase，GBSS）基因，并用Real-time PCR進一步地分析了GBSS基因在淀粉合成方面的功能。Cheng等［38］在2014年也從“美人紅”品種中克隆出了ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）基因序列，并進一步證實了AGPase是控制淀粉合成的關鍵酶。張莉等［39］在2015年克隆得到LrSSS（可溶性淀粉合成酶Soluble starch synthase，SSS）cDNA序列，并對其結構作了初步分析。以上這些研究結果為蓮淀粉合成代謝及分子機制的研究奠定了基礎。

另外，Wu等［40］在2014年克隆了蓮中苯丙氨酸氨裂解酶基因（NnPAL1），并對其進行了功能鑒定和分子進化分析，為被子植物的PAL蛋白家族的進化提供了新的見解。

以上的研究僅是關于蓮基因克隆和表達模式的初步分析，未涉及基因的生物功能的詳細闡述。目前僅有的生化功能研究來自對蓮sHSP17.5基因的研究，證明了sHSP17.5基因在擬南芥異源表達中提高了擬南芥的耐熱性［34］。

3　蓮測序的研究

隨著測序技術的發展，基因組測序變得越來越容易。中國古代蓮的基因組測序工作由中國科學院武漢植物園在2013年5月完成，并釋放了基因組數據（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/？val= AQOG01）［41］。同年武漢蔬菜研究所也公布了蓮基因組測序數據，并分析找出了與蓮種子長期存活和淀粉合成相關的基因，對開花植物的進化提供了新的見解［42］。此外，全志武等［43］在2011年對中國蓮和美洲蓮葉綠體基因組進行了測序，對比兩組葉綠體基因組序列，開發了蓮細胞器基因組分子標記，并結合其他80種植物葉綠體基因組序列，對蓮屬系統進化地位進行了分析。Cheng等［44］和Kim等［45］在2013年分別對不同蓮地下莖發育時期和部位進行了轉錄組測序，找到了控制蓮藕地下莖發育的關鍵基因。Wu等［46］在2014年對蓮葉綠體基因組進行了精確的測序分析，為雙子葉植物質體進化分析提供了新的見解。游永寧等［47］在2015年分別將野生花蓮和栽培藕蓮的轉錄組通過Illumima測序和組裝，并據此開發了蓮的EST-SSR標記。

目前，蓮的基因組學才剛剛起步，但已經得到了廣泛的關注。蓮的基因組和轉錄組數據分析對其系統進化研究、分子標記開發、基因功能的驗證等具有重大意義。

4　蓮屬染色體核型分析

蓮屬的兩個種都是二倍體，染色體數目為2n= 16，具有8對染色體。王寧珠等［48］在1985年對20個蓮品種進行了體細胞染色體的形態和核型分析，發現所有的品種都是二倍體。黃秀強等［49，50］和刁英等［51，52］分別對美洲黃蓮和中國蓮進行了核型分析，得出蓮核基因組大小約為950 Mbp的結果，其8條染色體在中期時總長約18 μm，其中最長的1號染色體長達4.7 μm。在8對染色體中，第1、5對染色體形態為近端著絲點，第4、6、7對為近中部著絲點，第2、8對為中部著絲，第4、5對染色體上有隨體結構。美洲黃蓮的核型不對稱系數為70.82%，中國蓮的不同品種的核型不對稱系數也在70%左右，所以蓮為不對稱核型。Diao等［53］利用分子核型和5S核糖體RNA基因間隔序列證明蓮屬物種遺傳多樣性是有限的，美國蓮被視為中國蓮的亞種更為合適。染色體核型分析為分子細胞遺傳學研究提供了基礎，是研究蓮的分類、演化以及染色體結構、形態與功能所不可或缺的重要手段。

5　展望

我國蓮研究起步相對較早，分子生物學研究也得到了大力的發展。隨著分子生物學技術的不斷發展，可以從分子水平對蓮的基因功能、性狀表達、遺傳變異的機制進行闡明，加速了蓮新品種選育，對促進蓮產業的發展、提升蓮產業的整體競爭力有重大意義。目前限制蓮分子生物學研究的瓶頸和亟待解決的熱點問題主要包括：與功能基因連鎖的分子標記的開發和利用，以及轉基因平臺的建立。

5.1與功能基因連鎖的分子標記的開發和利用

DNA分子標記的開發是近幾年來蓮分子生物學研究領域的熱點，目前用該方法在蓮的種質資源分類和鑒定、遺傳多樣性研究、遺傳圖譜的構建等方面都已經取得了大量的研究進展。但在蓮的育種方面可以開發出與功能基因連鎖的標記，直接篩選出優質、高產、抗病的蓮新品種，實現分子標記輔助育種。蓮具有豐富的種質資源，在分子生物學和相關學科的快速發展下，有望克服育種過程中的相關難點，縮短蓮品種選育周期，更有針對性地培育出所需要的蓮品種。

5.2轉基因平臺的建立

目前，關于蓮的轉基因尚未被報道，其原因主要有兩點：其一是植物轉基因是基于植物胚性愈傷培養基礎上的，到目前為止，僅有何子燦等［54］在1987年用花蓮胚性愈傷誘導分化出組培苗，刁英等［55］在2011年以鄂藕雜3號蓮藕頂芽或側芽的莖尖為外植體誘導胚性愈傷組織成功，并分化出幼苗，但胚性愈傷分化成苗率十分低。之后一直沒有關于蓮胚性愈傷的相關報道；其二是蓮基因組序列的測序結果在2013年5月才公布。植物組織培養技術和清晰的遺傳背景是轉基因工作開展的基石，雖然以上兩個原因使蓮的轉基因研究一直處于擱淺狀態，但相信蓮的基因組序列的公布將推進蓮轉基因研究和探索工作。

上述問題是阻礙蓮分子生物學研究進程的瓶頸，是目前最有可能克服的難題，也是今后一段時間蓮分子生物學亟待解決的熱點問題。

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10.3865/j.issn.1001-3547.2015.18.014

國家科技支撐計劃項目資助（編號：2012BAD27B01）

王劍雄，武漢大學生命科學學院，430072，E-mail：214065995@qq.com

鄭興飛，刁英，胡中立，武漢大學生命科學學院

2015-07-16