新型淀粉基止血材料的制備及生物相容性研究

王艷玲，劉光萬，吳麗娟，曲洪媛，趙芳，楊光，吳昌琳△

(1.華東師范大學物理系，上海磁共振重點實驗室，上海 200062； 2.蘇州博創同康生物工程有限公司，蘇州 215347)

1 引 言

出血是戰傷、外科手術和日常意外事故中常常遇到的問題，甚至危及人們的生命，因此，研究新型的快速、有效的止血材料一直是人們關注的話題[1-2]。對于血流量豐富、脆性大的實質性臟器如腦、肝臟、腎臟和脾臟等創面進行機械性止血易造成其組織損傷、針眼出血或裂口出血，嚴重的甚至影響器官的功能。

對此，國內外一直致力于研制對實質臟器創面迅速止血并且對其功能影響小、生物相容性好的止血材料。目前以分子篩吸水機理止血的血液因子濃縮類止血產品在臨床上和軍事上發揮重要的作用。如美國Z-Medica公司生產的QuikClot沸石基止血粉通過FDA的批準用于嚴重出血創傷的急救，然而其在使用時會產生超過100℃的高溫，造成創面組織的損傷[3～5]。美國Medafor公司生產的“Arista”可吸收性淀粉止血微球，雖然具有很好的安全性及良好的止血效果，但價格昂貴并且作為體內止血材料，其粘附性、吸液性不夠強，特別是表氯醇交聯劑可能存在潛在的毒性[6]，因此，針對以上血液因子濃縮類止血材料存在的不足，本研究介紹一種新型淀粉基止血材料的制備及其性能研究。

2 材料與方法

2.1 實驗材料及試劑

馬鈴薯淀粉，氫氧化鈉，鹽酸均由國藥集團化學試劑有限公司提供；透明質酸由華熙福瑞達生物醫藥有限公司提供(山東)；三偏磷酸鈉由亞科化學試劑有限公司提供(蘇州)；Arista微球購自美國Medfor公司。

2.2 實驗儀器

JJ-1型精密增力電動攪拌機，上海汗諾儀器有限公司；HH-5恒溫水浴鍋，金壇市瑞華儀器有限公司；DJ-V60A型電子天平，蘇州江東精密儀器；PH168A酸度計，蘇州英格泰電子科技有限公司；TDL-40B型離心機，上海安亭科學儀器廠；VFD2000G真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；Hitachi S-4800型電子掃描顯微鏡(日立)；Ultima IV X-射線粉末衍射儀，日本理學；DSC-6100差示掃描量熱儀，Seiko Instruments。

2.3 新型淀粉基止血粉

2.3.1制備方法 (1)可溶性淀粉的糊化：稱取一定量的淀粉并加入到蒸餾水中，加熱攪拌得到均勻透明的淀粉溶液，靜置待用。(2)交聯反應：按照一定的比例將透明質酸和三偏磷酸鈉加入到上述的淀粉溶液中。并加入氫氧化鈉，使溶液的pH維持在堿性環境。恒溫攪拌反應充分。(3)制備顆粒：加入鹽酸中和。取乳白色液體用蒸餾水反復洗滌數次，將所得沉淀物冷凍干燥。凍干的樣品粉碎成顆粒，保存待用。

2.3.2結構表征 (1)結構觀察：用肉眼觀察新型淀粉基止血顆粒的顏色及宏觀結構狀態；用電子掃描顯微鏡(SEM)觀察顆粒的微觀結構。(2)結構分析：材料反應前后的晶體結構測定用X-射線粉末衍射儀(XRD)，CuKα，40 kV×40 mA，掃描速度6°/min。

2.4 熱穩定性

用差示掃描量熱儀對實驗樣品進行熱穩定分析。加熱速率為10℃/min。

2.5 生物相容性研究

2.5.1皮膚刺激試驗和致敏試驗 根據刺激與遲發型超敏反應試驗[7]，每只新西蘭家兔分別有兩個試驗材料區域和兩個對照材料區域，分別將一定量的新型淀粉基樣品及對照組樣品(Arista止血微球)浸提液注射于設置好的皮膚區域，在規定的時間內觀察皮膚的紅斑和紅腫反應狀況(每種樣品分別用3只家兔)；致敏試驗采用小白鼠，隨機分為3組，每組3只。A組注射新型淀粉基止血材料浸提液，B組注射同等劑量的Arista止血微球浸提液，C組注射同等劑量的生理鹽水，隨后觀察包塊全身的反應及包塊吸收所用時間。

2.5.2全身急性毒性試驗 試驗采用昆明種小鼠12只，體重18～22 g。隨機分為2組，進食不禁水。試驗組注射新型淀粉基止血顆粒的浸提液，對照組注射生理鹽水。注射24、48和72 h后觀察小鼠的體重、飲食、呼吸、運動、排便和皮膚黏膜等的變化。

2.5.3細胞毒性試驗 試驗采用L929成纖維細胞，細胞毒性試驗按照國標GB/T 16886.5 MTT比色法進行。將制備好的細胞懸浮液接種于96孔培養板，并設陽性對照、陰性對照和空白對照，置于二氧化碳培養箱(37℃)培養24 h后除去上清液。陽性對照組加入陽性對照浸提液，陰性對照組加入陰性對照浸提液，空白對照組加入新鮮的細胞培養液，樣品組加入新型淀粉基止血粉浸提液，繼續培養72 h。然后在顯微鏡下觀察細胞的形態，計算細胞相對增值率同時評定細胞毒性[8]。

3 結果

3.1 掃描電鏡觀察

從電鏡照片可以看出，交聯前樣品(原淀粉)表面布滿裂紋，但是幾乎看不出有孔洞；而經過三偏磷酸鈉交聯工藝后，樣品(磷酸化的淀粉-透明質酸)表面及其內部具有許多相連的孔，呈現出三維網絡狀結構。這一結構大大增加了止血顆粒的比表面積，并有助于吸收血液的液體成分，阻止血液的固形成分形成凝膠，從而促進止血。

圖1 掃描電鏡圖片

3.2 X-射線衍射光譜分析

見圖2。

圖2 兩種樣品的X射線衍射圖片Fig 1 XRD image of two samples

從圖2中可以看出，原淀粉在2θ為18°處有強結晶峰，2θ在23°處有兩個微弱的結晶峰；但隨著交聯反應的發生，2θ為18°的強結晶峰逐漸減弱，并且在23°處的兩個弱結晶峰逐漸合并為一個。這表明原淀粉在交聯的過程中，結晶性遭到一定程度的破壞，形成了更多的無定形區域。

3.3 熱穩定性分析

由于結合水蒸發時所顯示的吸熱峰可以反映樣品交聯反應前后分子的變化，見圖3。新型交聯淀粉基樣品在100℃左右的吸熱峰面積明顯大于原淀粉的吸熱峰面積，表明該交聯淀粉基樣品中含有更高的結合水含量，由于少量透明質酸的加入可能有助于樣品保持更多的水分[9]。另外，值得一提的是新型交聯淀粉基樣品的吸熱峰溫度區域較原淀粉大，這可以解釋為交聯反應在一定程度上提高了新型淀粉基樣品的熱穩定性。

3.4 生物相容性分析

3.4.1皮膚刺激試驗 在新西蘭家兔脊柱兩側的實驗區域分別注射新型淀粉基樣品和對照組樣品的浸提液，并在24、48和72 h觀察試驗區域的皮膚反應情況。根據國家標準GB/T16886.10對皮膚反應程度的等級記分系統，新型淀粉基樣品一側和對照組樣品試驗側皮膚均沒有出現水腫、紅斑等，并且新型淀粉基樣品組和對照組的皮膚反應為0分。由此說明所制備樣品沒有皮內反應。

圖3 兩個樣品的DSC曲線Fig 3 DSC curves of two sample

3.4.2致敏試驗 新型淀粉基樣品組與Arista微球組致敏試驗表明試驗小白鼠的精神正常，呼吸和運動也均正常，并且試驗周圍皮膚未見明顯的水腫和紅斑等致敏作用；但是陽性對照組的注射區域和周圍皮膚均可見紅斑。

3.4.3全身急性毒性試驗 在注射樣品浸提液和生理鹽水后，新型淀粉基樣品組、Arista微球組和生理鹽水組的小白鼠在連續觀察期間活動、臨床表現正常，體重增幅也基本無差異，表明本研究所制備的新型淀粉基樣品無全身急性毒性反應。

3.4.4細胞毒性試驗 按照國家標準GB/T16886.5中規定的細胞毒性0 ～ 1級分級原則，陽性對照組為2級，陰性對照組為0級。本研究所制備的新型淀粉基止血材料的細胞毒性反應小于1級，因此符合臨床使用要求。有文章表明一定量的透明質酸具有選擇性調節成纖維細胞黏附和增殖的功能[10]，這也是該新型淀粉基止血材料優于其他止血材料的功能。

4 討論

本研究以馬鈴薯淀粉為主要原料，加入少量透明質酸并通過三偏磷酸鈉的交聯工藝制備出的可完全降解吸收的多糖顆粒具有三維網狀結構。該顆粒可迅速吸收血液中的水分，同時有效阻止血液中的固形成分(如止血因子、紅細胞、血小板和纖維蛋白原等)形成凝膠；另外固形成分的凝聚加快了內源性凝血機制的啟動，因此，該新型淀粉基止血材料具有非常好的止血功能。另外通過DSC熱穩定性分析可知，新型淀粉基止血材料較原淀粉具有良好的熱穩定性，有利于材料的加工，存儲及使用。

止血材料必須經過一系列的實驗驗證具有良好生物相容性才能應用于臨床。本研究按照國家標準GB/T16886醫療器械生物學評價系列展開了較全面的動物實驗。實驗結果表明：無皮內和致敏反應、無全身急性毒性反應、無細胞毒性，證明該新型淀粉基止血材料具有良好的生物相容性。

因此，此新型淀粉基止血材料是一種較為理想的止血材料，改進了現有止血材料的弊端，有望應用于臨床實踐中。