雨生紅球藻的大規模培養以及蝦青素的提取技術

徐青山 李曉香 張 嬌 秦玉明 駱其君

（1.程海保爾生物開發有限公司，云南 麗江674202；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波315211）

蝦青素是近年來走入國際研發領域的類胡蘿卜素。它廣泛存在于自然界中，也是海洋動物體內最主要的類胡蘿卜素之一。研究表明，蝦青素具有強大的清除氧自由基的能力，其抗氧化性是類胡蘿卜素的10倍，是維生素E的550倍，被譽為“超級抗氧”[1-2]。鑒于蝦青素的抗氧化功能，且對人體的絕對安全性，在國外已被廣泛應用于醫藥，食品，保健及水產養殖業中[3-4]。雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）在特定的條件下可積累本身干重的1%以上的蝦青素，是天然蝦青素“濃縮品”和最好的生物來源[5-6]。

雨生紅球藻是一種淡水單細胞微藻，屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、紅球藻科、紅球藻屬。其具有特殊的生物學性質，即在弱光及營養豐富的條件下，以游動的綠色營養細胞存在，而在不利于其生長的條件下，以不動厚壁孢子存在，同時在體內積累大量的蝦青素[7-8]。鑒于雨生紅球藻此生長特點，目前國際上成功的生產模式都采用了兩階段生產方式，即先采用封閉式光生物反應器培養系統實現細胞的高密度營養生長、克服污染問題，再采用流行的開放池系統在脅迫條件下使細胞積累蝦青素[9]。本項目旨在利用雨生紅球藻的培養及蝦青素的提取實驗中獲得的方法，結合現實生產條件，將技術應用到生產實際中，進一步的推廣雨生紅球藻的大規模培養和蝦青素的提取技術。

1 雨生紅球藻的大規模培養

目前雨生紅球藻的培養主要分為兩個階段：細胞生長繁殖階段和蝦青素的積累階段。

1.1 細胞生長繁殖階段

雨生紅球藻的生長繁殖階段采用逐級擴大培養的方式。各級培養所需淡水取自程海湖，營養液配制與補充均采用MAV母液。

1.1.1 一級培養

利用5000ml三角瓶室內密封恒溫培養。三角燒瓶使用之前用草酸清洗并用清水沖洗三遍，每瓶加入培養所用淡水，加熱煮沸消毒后用牛皮紙和橡皮筋密封并冷卻至室溫。加入適量營養鹽母液后，藻液按1：3的比例接入，接種細胞密度為1000～6000個/毫升，密封培養。光照強度控制在4000～5000lx，每天搖瓶3～4次以保證充足的二氧化碳溶解量，室內溫度控制在25～27℃。每天取樣計數，監測藻細胞的濃度。待細胞處于指數生長期時，取一部分藻液繼續用于一級培養，以保證藻種的規模；一部分用于二級培養，以逐級擴大生產規模。

1.1.2 二級培養

利用50L白色塑料桶密封充氣培養。充氣系統包括鼓風機，主充氣管，支充氣管和氣石，支充氣管和氣石需加熱煮沸消毒后才可使用。白桶使用之前用消毒水清洗并用清水沖洗干凈，加入淡水45L后再加入消毒片消毒。消毒6h后加入適量硫代硫酸鈉中和漂白精，待完全中和后加入營養鹽母液并接入一級培養至指數生長期的藻種，接種比例根據藻液的濃度確定，并將已加熱消毒后的支充氣管和氣石安裝好進行充氣，用尼龍塑料和橡皮筋密封。培養過程中光照控制在4000—5000lx。每天計數監測藻細胞密度，待藻細胞進入到指數生長期時，培養至細胞密度為10萬～25萬個/毫升，擴大至三級培養。

1.1.3 三級培養

利用100～200 m2水泥池攪拌培養。消毒池和攪拌車用消毒水清洗干凈后，加入培養所需淡水，高度控制在30～40cm。按照比例均勻加入漂白粉原池消毒過夜。消毒6h后加入適量硫代硫酸鈉中和漂白粉，待完全中和后加入營養鹽母液并接入藻種，攪拌培養，光照控制在5000～6000 lx。每天計數監測藻細胞密度，培養至雨生紅球藻細胞密度達到6萬～12萬個/毫升，到達適宜密度時用于下一步生產流程。

關于雨生紅球藻的大規模培養技術，已取得了一項專利：大規模培養雨生紅球藻和轉化蝦青素的裝置和簡易方法（專利號：ZL200610154678），并有一項專利已受理：一種培養雨生紅球藻生產蝦青素的方法（申請號：200910099708.6）。

1.2 蝦青素的積累階段

蝦青素的積累階段需要建特殊的收集池。收集池面積大至和三級培養池相同，約100～200m2，池底要鋪表面光滑的瓷磚，并要有一定的坡度，以便沖洗收集。

待三級培養的雨生紅球藻到達一定的濃度，將上層活力較好的藻細胞液轉移到收集池。三級培養池底層的藻液含有較多的死細胞和雜質，將其丟棄。轉移至收集池的雨生紅球藻，光照強度控制在10000lx以上，利用攪拌車進行攪拌并加入一定濃度的氯化鈉，進行其蝦青素的積累過程。待到藻細胞完全變為孢子，上層水體已基本無顏色，便可進行下一步生產程序。

2 雨生紅球藻的收集

經過蝦青素的積累階段之后，藻細胞已完全轉化為紅色孢子，沉入池底，上層藻液已無藻細胞，水色變清。此時將上層清水排至污水處理廠，之后通過較大的水容器連接收集池的排水口和高速連續離心機，進行雨生紅塵球藻的收集。收集過程中，用水泵將收集池底的雨生紅球藻沖至排水口的水容器，同時利用高速連續離心機對沖出的含雨生紅球藻的水體進行離心，完成雨生紅球藻的收集過程。

3 蝦青素的提取

經過離心收集后的雨生紅球藻藻粉，首先進行噴霧干燥，之后利用超聲波技術對雨生紅球藻進行破壁處理，之后利用蝦青素的脂溶性特性，對處理后的藻液進行油溶萃取，萃取后的脂溶液進行離心處理，收集上清液，得到蝦青素，蝦青素累積可達1.0%以上。在雨生紅球藻的收集，蝦青素的提取技術方面從擴紅球藻的食品加工方面，已取得一項專利：一種紅球藻、菊署的食品及其制備方案（專利號：ZL200910099707.7）。

雨生紅球藻中蝦青素的含量很高，是天然蝦青素的最好生物來源，如何大規模的培養雨生紅球藻以及從中高效率的提取蝦青素已成為生產天然蝦青素的重要途徑。相比于國外先進的生產技術，我國雨生紅球藻的培養及蝦青素提取技術尚處于實驗起步階段，本文創新了雨生紅球藻的培養及蝦青素的提取實驗中獲得的方法，為國內首次報道，再結合生產實際條件，運用適宜的生產設備，將該技術措施應用到生產實踐中，將進一步的推廣雨生紅球藻的大規模培養和蝦青素的提取技術，獲得了適應范圍廣，生長速度快，蝦青素累積可達1.6%以上的技術指標，將產生良好的示范效應，推動我國微藻養殖與加工及市場開發相銜接的新型產業鏈發展。

［1］李曉夢,齊安翔,蔡明剛,等.雨生紅球藻室外大體積培養與蝦青素積累初步研究[J].廈門大學學報,2006,5：245-249.

［2］莊惠如,陳必鏈,王明茲,等.雨生紅球藻混合營養與異養研究[R].微生物學通報,2000,27：198-201.

［3］蔡明剛,王杉霖,李文權,等.天然蝦青素在水產養殖中的應用研究進展[R].臺灣海峽,2003,22：377-385.

［4］CrungM D,S ouzaF ML,B orowitzkaM,et a l.Algalca rotenoidsH.S econdaryc arotenoids2.H aematococcuspl uvialisa planosproesasa so astaxanthine sters[J].JA pplph ycol,19,92(4)：165-171.

［5］莊惠如,盧海聲,陳必鏈,等.雨生紅球藻營養細胞的蝦青索累積[J].水生生物學報,2001,25(4)：376-378.

［6］魏東,減曉南.大規模培養雨生紅球藻生產天然蝦青素的研究進展和產業化現狀[J].中國海洋藥物,2001(5)：4-8.

［7］殷明焱.雨生紅球藻細胞周期及調控研究[J].中科院海洋研究所,1998.

［8］CrungM D,S,Borowitzka,etal.Algalca rotenoids.Secondaryc arotenoids.H aematococcuspl uvialisa planosproesasa so astaxanthine sters[J].JA pplph ycol,1992(4)：165-171.

［9］FischerP,Kl einU.L ocalizationo fn itrogen～assimilatingenz ym es in t he c hloroplasto fC hlamydomonasr einhardtii[J].Pla nt P h ysiol,1988,88(1)：947-952