X射線全身照射對小鼠胸腺重量 細胞數(shù)及細胞凋亡的影響

徐瑞明　張占春　金順子★

X射線全身照射對小鼠胸腺重量 細胞數(shù)及細胞凋亡的影響

徐瑞明張占春金順子★

目的 探討X射線軀體輻射對小鼠胸腺重量、細胞計數(shù)及細胞凋亡的影響。方法 2.0Gy與0.075Gy X射線照射后0、2、4、8、16、24及48h，采用直接稱重、顯微鏡下計數(shù)、流式細胞術(shù)分別檢測小鼠胸腺的重量、細胞數(shù)及細胞凋亡情況。結(jié)果 2.0Gy X射線照射后小鼠胸腺重量先升高后下降，而胸腺細胞數(shù)顯著下降，到48h兩者均降至最低水平；而胸腺細胞凋亡顯著增加，48h達到最高水平。0.075Gy照射后胸腺重量及胸腺細胞數(shù)顯著升高而胸腺細胞凋亡沒有明顯變化。結(jié)論 高劑量輻射（HDR）作用下胸腺的重量、細胞計數(shù)下降，而胸腺細胞凋亡增加，對免疫系統(tǒng)有明顯的抑制作用。低劑量輻射（LDR）可以在一定程度上促進胸腺的重量增加、細胞數(shù)目增多，細胞凋亡減少，有免疫興奮作用。

電離輻射 胸腺 細胞凋亡

免疫系統(tǒng)對腫瘤的監(jiān)視與機體的先天性和獲得性免疫功能有關(guān)，單核巨噬細胞系統(tǒng)、T 淋巴細胞和NK細胞以及相關(guān)的細胞因子和抗體等均參與機體對腫瘤的免疫監(jiān)視作用。胸腺作為中樞免疫器官，是淋巴樣干細胞（LSC）分化為成熟T細胞的唯一場所。來源于胸腺的淋巴細胞對輻射十分敏感，因此胸腺在輻射免疫中占有重要地位。中等劑量以上的電離輻射降低免疫功能，亦是輻射致癌發(fā)生的基礎(chǔ)之一。低劑量輻射（LDR）可以增強免疫功能，是輻射興奮效應(yīng)的重要組成部分，在放射生物學(xué)和放射醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中備受關(guān)注［1］。T淋巴細胞數(shù)量的變化是高劑量輻射（HDR）抑制免疫反應(yīng)和LDR增強免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一［2］。作者自2010年4月至6月觀察了2.0Gy及0.075Gy X射線作用下小鼠胸腺的重量、細胞計數(shù)及細胞凋亡的變化，從相對宏觀角度探討電離輻射對免疫系統(tǒng)的影響。報道如下。

1　材料和方法

1.1實驗動物 雄性健康昆明系普通級小鼠共60只，體重18～22g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實驗動物部提供。1.2 照射條件 國產(chǎn)X.S.S.205（FZ）型固定式 X射線深部治療機，電壓180kV，電流15mA，濾板0.5mmCu+1.0mmAl。單次LDR（0.05～0.2Gy），靶皮距280cm，吸收劑量率12.5mGy/min。＞0.5Gy劑量照射時，靶皮距66.5cm，吸收劑量率0.287Gy/min。

1.3方法 采用簡單隨機法將動物分為HDR組30只和LDR組30只，分別予2Gy、0.075Gy X射線軀體照射0、2、4、8、16、24 及48h，各組小鼠照射后斷頭處死，迅速取出胸腺，電子天平稱重，記錄實驗結(jié)果。然后分別置于PBS中，用毛玻璃片擠壓，制成細胞懸液后用200目尼龍網(wǎng)過慮，去除結(jié)締組織，1500 rpm離心1min棄上清液，PBS洗滌2次。胸腺細胞一部分制成單細胞懸液，涂片，通過熒光顯微鏡進行計數(shù)分析；另一部分應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.4細胞凋亡檢測 采用美國B-D公司生產(chǎn)的FACScan流式細胞儀，激發(fā)光源為15mW氟離子激光，波長488nm。應(yīng)用直接熒光法檢測，F(xiàn)ACS軟件收集細胞，CellQuest軟件分析處理數(shù)據(jù)，記錄凋亡細胞百分率。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 分別用Excel和SPSS15.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較使用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1X射線照射后小鼠胸腺重量的變化 見表1。

表1　不同劑量X射線照射后小鼠胸腺重量的變化［mg（±s）］

表1　不同劑量X射線照射后小鼠胸腺重量的變化［mg（±s）］

注：與0h比較，*P＜0.05，**P＜0.01

135.40±18.28135.40±18.28 2 158.80±10.96*170.20±19.60* 4 141.00±26.32156.60±18.09 8 131.80±19.11167.60±22.40* 1698.00±14.09**159.20±20.95 2466.60± 2.88**158.20±27.69 4843.60±4.34**146.40±11.19時間 （h）HDR組LDR組0

2.2X射線照射后小鼠胸腺細胞計數(shù)的變化 見表2。

表2　不同劑量X射線照射后小鼠胸腺細胞計數(shù)的變化［×107（±s）］

表2　不同劑量X射線照射后小鼠胸腺細胞計數(shù)的變化［×107（±s）］

注：與0h比較，*P＜0.05，* *P＜0.01

28.44±11.5128.44±11.51 2 20.05±3.5130.80±5.77 4 23.60±8.7033.84±5.45 8 14.65±3.81*32.95±9.30 1610.84±2.31*21.50±4.86 246.40±1.56**33.00±2.70 484.40±1.04**44.58±3.44*時間（h）HDR組LDR組0

2.3X射線全身照射后小鼠胸腺細胞凋亡率的變化 見表3。

表3　不同劑量X射線照射后小鼠胸腺細胞凋亡率的變化［%（>±s）］

表3　不同劑量X射線照射后小鼠胸腺細胞凋亡率的變化［%（>±s）］

注：與0h比較，*P＜0.05，* *P＜0.01

0.058±0.020 0.058±0.020 2 0.040±0.017 0.038±0.014 4 0.114±0.0420.054±0.020 8 0.138±0.036 0.068±0.014 16 0.126±0.021* 0.020±0.004 24 0.220±0.056* 0.094±0.016 48 0.310±0.037** 0.106±0.028時間 （h）HDR組LDR組0

3　討論

LDR與較大劑量軀體照射所引起的小鼠胸腺細胞周期進程的變化截然不同，LDR引起明顯的刺激效應(yīng)；而HDR導(dǎo)致顯著的抑制效應(yīng)［3］。2.0Gy照射后胸腺重量先升高后下降，而細胞計數(shù)無升高，并從8 h開始呈時間依賴性顯著下降。HDR作用下胸腺重量在2h時顯著升高，而此時細胞計數(shù)卻沒有顯著變化，這種現(xiàn)象可能與早期胸腺充血水腫及一些細胞因子的分泌有關(guān)，而并不直接影響胸腺細胞增殖或凋亡。這種機制也解釋了臨床上2.0Gy放療后患者早期腫瘤病灶并不明顯縮小甚至增大的原因。有文獻報道在輻射損傷發(fā)生的早期，胸腺組織VEGF mRNA表達水平顯著增高，在促進血管內(nèi)皮細胞增殖、抗凋亡以及促使受輻射組織血管新生中起到重要作用［4］。胸腺重量和細胞計數(shù)均呈時間依賴性下降，從組織水平上進一步證明HDR具有時間依賴性的損傷效應(yīng)，為輻射損傷及腫瘤治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

本實驗結(jié)果提示0.075Gy照射后胸腺重量及細胞計數(shù)顯著高于照射前，表明LDR可以促進胸腺細胞的增殖，使胸腺重量增加，從組織水平證明了LDR具有一定的免疫興奮效應(yīng)。有文獻［5］報道，0.075Gy照射后IL-12、IFN-γ的分泌量在照射后12h內(nèi)變化不明顯，而后IL-12于24、72 h，IFN-γ于48 h均出現(xiàn)顯著升高，這可能與樹突狀細胞、T淋巴細胞的活化有關(guān)。TGF-β1含量在照射后不同時間均較對照組明顯降低。這些細胞因子的時程變化與本實驗中細胞計數(shù)的變化基本一致，進一步解釋了本資料中胸腺在細胞、組織水平上的變化。

胸腺重量顯著增加發(fā)生在細胞計數(shù)增加的40多個小時前，其原因可能是在LDR興奮作用下導(dǎo)致血液循環(huán)增加、激發(fā)炎癥反應(yīng)、細胞因子分泌增多等導(dǎo)致胸腺重量的增加，從而為以后促進細胞分裂或抑制細胞凋亡作好了充分的物質(zhì)準(zhǔn)備。LDR改變了免疫細胞外環(huán)境，促使胸腺細胞成熟、分化和增殖加速，凋亡減少［6］。0.075Gy X射線使胸腺CD4-CD8-細胞比例增高而其他亞組的細胞比例無改變，而且CD3+細胞數(shù)比例增高，說明0.075Gy X射線一方面促使胸腺細胞更新，另一方面加速胸腺細胞的成熟分化［7］。這種免疫興奮效應(yīng)增強了機體免疫力，有助于緩解患者及家屬對于LDR有關(guān)的臨床檢查的擔(dān)憂與恐懼。

本實驗表明2.0Gy照射后胸腺細胞凋亡逐漸升高，48 h時達到最高水平。2.0Gy照射后胸腺重量、細胞計數(shù)的變化基本一致，而細胞凋亡的變化卻與之相反，這說明了3者之間存在著密切的關(guān)系：在HDR作用下，細胞凋亡的增多導(dǎo)致了細胞數(shù)減少，最終導(dǎo)致胸腺重量下降。有實驗［8］證明LDR 0.05Gy和0.075Gy全身照射后，胸腺細胞的凋亡明顯低于對照組，劑量超過0.20Gy時，細胞凋亡開始增加，2.0Gy和4.0Gy組細胞凋亡顯著高于對照組。6Gy60Coγ射線照射胸腺后1～6d，促凋亡基因和抑制凋亡基因處于一個動態(tài)的變化之中，當(dāng)促凋亡基因占優(yōu)勢時，細胞即開始發(fā)生凋亡，細胞增殖受到抑制，這很可能是照射后早期（3～24 h）凋亡率持續(xù)升高、損傷不斷加重的重要原因之一［9］。LDR使CD4+細胞的輔助功能和CD8+細胞抑制功能增高，而且流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡不但未增多甚至出現(xiàn)減少。本資料中0.075Gy照射后胸腺細胞凋亡也受到抑制，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其原因可能是細胞凋亡的顯著性改變多發(fā)生在48h之后。有實驗數(shù)據(jù)［10］表明，將小鼠進行0.075Gy X射線軀體照射24h，其脾細胞經(jīng)Con A刺激48 h，細胞外液使2Gy X射線全身照射后體外培養(yǎng)的小鼠胸腺細胞凋亡降低，尤其在培養(yǎng)后72 h 降低明顯。

綜上所述，在2.0Gy X射線作用下胸腺的重量、細胞計數(shù)呈時間依賴性逐漸下降，而胸腺細胞凋亡呈時間依賴性增加，說明HDR對免疫系統(tǒng)有明顯的抑制作用。0.075Gy X 射線照射可在一定程度上促進胸腺的重量增加、細胞數(shù)目增多，說明LDR有某種免疫興奮作用，其中更深層次的機制有待進一步研究。

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Objective To study the effect of mouse WBⅠ（whole body irradiation，WBⅠ）with X-rays on weight，cell number and apoptosis of the thymus. Methods Weighing，microscope count and fl ow cytometry were respectively used to detect the changes in weight，cell number and apoptosis of the mouse thymus at different times（0，2，4，8，16，24 and 48 h） after WBⅠ with X-rays of 0.075 and 2.0Gy. Results The weight of thymus in mice fi rstly increased and then decreased； cell counts decreased gradually in a time-dependent manner；both reached their nadir at 48h；while the apoptosis of thymocytes increased in a time-dependent manner and peaked at 48h after WBⅠ with X-rays 2.0Gy. The weight and cell number of thymus were promoted signifi cantly and apoptosis did not change signifi cantly after WBⅠ with X-rays 0.075Gy. Conclusion HDR could reduce the quality of thymus，decrease cell accounts and enhance apoptosis. LDR could improve the quality of thymus，increase cell accounts and inhibit apoptosis to some extent. HDR could signifi cantly inhibit immune system while LDR could stimulate immune system.

X-irradiation Thymus Apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項目（30100033）

315041 浙江省寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院放療科（徐瑞明 張占春）

130021吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射生物教研室（金順子）