血管生成素-2與大腸癌淋巴管密度的相關性研究

譚風波 喻南慧 徐海帆★

血管生成素-2與大腸癌淋巴管密度的相關性研究

譚風波 喻南慧 徐海帆★

目的 通過檢測大腸癌標本的血管生成素-2（ANG-2）mRNA的表達，并進行微淋巴管計數，探討ANG-2 mRNA的表達與微淋巴管密度（MLVD）的關系，推斷其在大腸癌微淋巴管生成中的作用。方法 應用RT-PCR檢測癌組織、良性病變及手術切緣正常組織的ANG-2 mRNA的表達；應用免疫組化技術，以LYVE-1標記微淋巴管并計數。結果 ANG-2 mRNA在癌組織內陽性表達64.0%，良性病變內陽性表達8.3%，手術切緣正常組織內陽性表達7.5%。ANG-2 mRNA表達陽性的癌旁MLVD比陰性高（P＜0.01），且ANG-2 mRNA的表達水平與癌旁MLVD存在相關性（P＜0.05，r=0.493）。癌旁MLVD及手術切緣正常組織MLVD比癌組織高（P＜0.01），且癌旁MLVD比手術切緣正常組織MLVD高（P＜0.01）。Duke's A、B期的癌旁MLVD較C、D期低；有淋巴結轉移的癌旁MLVD比無淋巴結轉移的癌旁MLVD高（P＜0.05）。結論 ANG-2 mRNA在大腸腺癌組織內有高表達并與癌旁MLVD的表達水平密切相關。

大腸腺癌 血管生成 淋巴管生成 血管生成素-2

大腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，淋巴道轉移是影響大腸癌療效和預后的主要因素之一。腫瘤淋巴道轉移需通過新生淋巴管，因此研究腫瘤淋巴管生成有利于找到對應的靶向治療目標，為大腸癌防治提供臨床指導。近期研究發現血管生成素-2（ANG-2）/ Tie-2系統對淋巴管的發育和生長也有重要影響，但ANG-2的高表達是否促使各類腫瘤的淋巴結轉移尚存在很大的爭議，特別在大腸腺癌研究中，缺少對ANG-2與腫瘤微淋巴管密度的定量相關性分析。

1　臨床資料

1.1一般資料 選擇2009年7月至2009年11月南華大學附屬第一醫院經外科手術獲取的大腸癌標本50例，其中男28例，女22例；年齡35～81歲，中位年齡57.2歲。所有患者術前均未行化療及放療，均獲患者知情同意，且臨床資料完整。所獲標本：切取大小0.5cm×0.5cm×0.5cm的癌組織、正常腸壁黏膜組織，分別置入液氮、福爾馬林液體。結合術后病理科診斷以核實取材正確并診斷分期。病理組織學分型包括高-中分化腺癌17例，黏液腺癌及印戒細胞癌統稱為差分化腺癌、低分化腺癌33例；Duke's期A～B期27例、Duke'sC～D期23例，診斷標準按照我國結直腸癌協作組制定的結直腸癌臨床病理分期標準。另收集南華大學附屬第一醫院大腸良性病變12例為對照組，男5例，女7例；年齡8～67歲，平均年齡（50.3±0.12）歲。

1.2主要試劑及方法 鼠抗人CD34單克隆抗體、通用型二氨基聯苯胺/DAB染色試劑盒及SP Kit廣譜免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。鼠抗人LYVE-1單克隆抗體購自福州邁新生物技術有限公司。MarkerⅡ、2×Taq PCR MasterMix 、TRIzol 及Reverse Transcription System購自上海生工生物工程有限公司。（1）RT-PCR檢測ANG-2 mRNA的表達：引物由上海生工生物工程有限公司合成（ANG-2，上游引物：5'-TTGGAACACTCCCTCT-3'； 下游引物：5'-TCACGT CGCTGAATAA-3'擴增片段506bp。β-actin，上游5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'；下游：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'擴增片段317bp）。先行RNA的提取，再進行逆轉錄及聚合酶鏈反應，取逆轉錄反應產物1μl、2×PCR Buffer 10μl、上游引物和下游引物各1μl、超純水7μl。進行熱循環，具體反應條件如下：（94℃，2min）1Cycle；（94℃，30s），（48℃，30s），（72℃，45s）35 Cycles；（72℃，5min）1Cycle；4℃保存，電泳，紫外透視分光儀攝片，經凝膠密度掃描系統處理，測定灰度值。計算ANG-2條帶與β-actin條帶灰度值比。（2）免疫組化：對50例結腸癌的病理蠟塊，制作石蠟切片，厚4μm，用3% H2O2滅活內源性過氧化物酶10min，PBS（pH7. 4）水洗。然后分別與一抗（鼠抗人CD34、LYVE-1，1∶200稀釋），二抗及過氧化物酶標記的鏈霉素親和素抗體孵育，以PBS代替一抗作為陰性對照。PBS水洗后DAB顯色15 min，蘇木素復染，封片觀察。

1.3微淋巴管判定與計數 由兩位病理科醫師分別進行雙盲閱片，顯微鏡下LYVE-1+/CD34-內皮細胞定義為微淋巴管。微淋巴管密度（MLVD）的結果判定如下：在低倍鏡（×100倍）下尋找LYVE-1陽性脈管密集區，換高倍鏡（×400倍）選取3個視野計數，取其平均值計算MLVD。

1.4統計學處理 采用SPSS16.0軟件。采用卡方檢驗、兩獨立樣本的t檢驗、直線回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1ANG-2 mRNA的表達情況 見表1、圖1。

表1　不同組織中ANG-2 mRNA的表達比較［n（%）］

2.2各組中MLVD的表達情況與及MLVD與大腸腺癌的臨床病理的關系 見表2、3。

表2　不同組織中MLVD的的表達情況

表2　不同組織中MLVD的的表達情況

分組nMLVD癌組織503.17±2.51良性病變126.32±1.96手術切緣正常組織507.69±1.87

表3　MLVD與大腸腺癌的臨床病理關系

表3　MLVD與大腸腺癌的臨床病理關系

MLVDt值P值Duke's分期3.47＜0.01 A/B276.40±2.15 C/D238.98±2.95分化程度2.06＜0.05差/低338.23±3.14高/中176.45±2.30淋巴結轉移2.05＜0.05無156.04±4.46有358.42±3.38遠處轉移0.15＞0.05無387.62±4.67有127.86±5.51性別0.12＞0.05男287.74±2.53女227.63±3.56年齡0.29＞0.05≤50歲197.49±3.05＞50歲317.82±4.19 n

2.3免疫組化 各組微血管密度（MVD）及MLVD的染色情況。見圖2。

圖1　ANG-2 mRNA表達

圖2　各組免疫組化MVD及MLVD的染色

2.4ANG-2 mRNA的表達與MLVD的關系 50例大腸腺癌組織中，32例ANG-2 mRNA陽性表達的癌旁MLVD高于18例ANG-2 mRNA陰性組，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）見表4。32例ANG-2 mRNA陽性表達組中，ANG-2 mRNA的表達量與癌旁MLVD成正相關性（P=0.002，r=0.493）。見圖3。

圖3　ANG-2 mRNA的表達量與癌旁MLVD之間回歸性分析

表4　ANG-2 mRNA的表達與癌內MVD及癌旁MLVD之間的關系

3　討論

血管生成素家族（ANGs）是1996 年發現的一族蛋白分子，包括ANG-1、 ANG-2、 ANG-3 及 ANG-4共4種分子［1］，其作用各異。ANG-1和ANG-2是目前研究較廣泛且功能較明確，二者共同的受體Tie2屬于受體酪氨酸激酶（RTK）家族成員。

ANG-2在淋巴管生成中的作用近幾年才有報道，研究發現 ANG-2/Tie2 系統對淋巴管的發育和生長也有重要影響，ANG-2與Tie2在LECS（淋巴管內皮細胞）中的協同表達提示ANG-2在淋巴管生成中的作用［2，3］。剔除ANG-2基因的小鼠發生淋巴管發育與功能缺陷，出現乳糜腹水，表明 ANG-2 對于正常淋巴管的形成和穩定是必需的［4］。Kim KE［5］等通過兔耳及氣道損傷模型首次發現血管生成素家族能促進淋巴管生成。亦有報道，ANG-1/ANG-2均能與腸系膜的LECS的Tie2結合并使其磷酸化，ANG-2催進LECS增殖作用較ANG-1強，而ANG-1促遷移作用更顯著［6］。

隨著一些淋巴管內皮細胞標記物陸續被發現，其中具有代表性的有血管內皮生長因子-C（VEGF-C）、血管內皮生長因子-D（VEGF-D）、 血管內 皮 生 長 因子 受 體 3（VEGFR-3）、LYVE-1、 Podoplanin、Prox-1等，為淋巴管的研究提供了可靠的實驗方法［7］。本資料中，連續切片的同一視野下，未發現LYVE-1和CD34均為陽性的管腔，LYVE-1陽性管腔中未發現紅細胞，表明LVYE-1用于大腸癌的腫瘤微淋巴管標記行MLVD計數是切實可行的。作者通過免疫組化標記淋巴管內皮細胞經顯微觀察發現，大腸癌新生微淋巴管主要集中于癌旁區，癌內中央區則最稀疏。癌旁微淋巴管多擴張明顯，未見完整的管腔，有開放腔面，周圍大量淋巴細胞浸潤。中央區則多呈閉鎖狀或條索狀，甚至完全缺如，部分為單個著色的淋巴內皮細胞，表明癌旁淋巴管不僅數量且形態功能上更有利于腫瘤細胞的轉移。有文獻報道［8，9］，出現癌旁區、 癌內中央區微淋巴管分布及形態的差異可能是由于腫瘤細胞在中央區增殖產生的高壓不利于微淋巴管生成。即使有微淋巴管生成，也因易受壓而變細、 塌陷、 萎縮或因腫瘤細胞入侵，淋巴管結構被破壞，從而處于無功能狀態。而在前緣區，腫瘤組織間壓力較低，有利于微淋巴管的形成而成為真正有功能的淋巴管。分析本實驗結果得出癌旁MLVD與大腸腺癌的臨床病理參數的關系顯示癌旁MLVD與大腸腺癌的組織學分化程度、Duke's分期及淋巴結轉移相關，而MLVD與遠處轉移、性別及年齡并無明顯關系，因而可以推斷大腸癌的癌旁MLVD可作為指導術后治療及預后的一個可靠因素，區域淋巴系統有抗腫瘤遠處轉移的作用。

目前關于ANG-2能否促進腫瘤微淋巴管生成的研究較少。在乳腺癌體外培養實驗中證明ANG-2上調特異的淋巴管生成因子之一VEGFR-3的表達而間接達到促進腫瘤新生淋巴管形成的作用，同時通過利用可溶性Tie2結合ANG-2使淋巴管內皮細胞的增殖率減少50%［10］。少部分國內外的研究報道，ANG-2較ANG-1與腫瘤的淋巴結的轉移關系密切［11］，但ANG-2的高表達是否促使各類腫瘤的淋巴結轉移研究結果不盡一致［12］。本資料顯示ANG-2 mRNA的表達量及MLVD成正相關性，從而推斷ANG-2在大腸腺癌內高或過表達對大腸腺癌中微淋巴管的生成可能起促進作用，進而為腫瘤細胞沿新生的淋巴管遷徙和轉移提供途徑，是促使腫瘤淋巴管轉移的一個重要因子。

綜上所述，大腸癌淋巴管生過程中ANG-2具有的重要作用，但要明確ANG-2作用的具體調控機制及影響因素，仍需要通過建立大腸癌動物模型，進行體內外實驗來進一步驗證。通過動物實驗積極尋找阻斷ANG-2作用途徑的靶點，將成為拮抗大腸癌微淋巴管生成的一個新方向。

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4 Gale NW. Angiopoietin- 2 is required for postnatal angiogenesis and lymphatic patterning， and only the latter role is rescued by Angiopoietin-1 . Dev Cell，2002，3（3）：411～423.

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Objective Expression of angiopoietin-2mRNA was detected and microlymphatic vessel density（MLVD）was counted in CRC，then investigated correlation of the expression of ANG-2mRNA with MLVD in order to deduce relation of ANG-2 with lymphangiogenesis in CRC indirectly. Methods RT-PCR was applied to detect expression level of ANG-2mRNA in cancer tissue，benign tissue and normal surgical margin tissue，and MLVD marked by LYVE-1 was counted by morphometric. Results （1）In all samples，positive rates of ANG-2mRNA in CRC's cancer tissue，benign tissue and normal surgical margin tissue were（32/50），（1/12）and（3/50）respectively.（2）There were 32 samples that ANG-2mRNA were positive，and among these samples peritumoral MLVD was higher than that in negative group（P＜0.01）；there were a correlation between ANG-2mRNA expression level and peritumoral MLVD（P＜0.05，r=0.493）.（4）MLVD of peritumoral and normal surgeral margin's were higher than intratumoral MLVD（P＜0.01），peritumoral MLVD was higher than normal surgeral margin's MLVD additional（P＜0.01）.（5）level of peritumoral MLVD in Duke's A-B stages was lower than C-D stages of CRC（P＜0.05）；MLVD with lymphatic metastasis was higher than without lymphatic metastasis（P＜0.05）.Conclusions ANG-2 was high expressed in CRC，ANG-2 expression levels have closely relation with peritumoral MLVD.

Colorectal-cancer Angiogenesis Lymphangiogenesis A ngiopoietin-2

421001南華大學附屬第一醫院腫瘤外科（譚風波 徐海帆）410007長沙市婦幼保健院（喻南慧）