血清miRNA-124 miRNA-221在缺血性腦卒中的臨床應(yīng)用

周曉冬 郝瑞 肖小平

血清miRNA-124 miRNA-221在缺血性腦卒中的臨床應(yīng)用

周曉冬 郝瑞 肖小平

目的 探討血清miRNA-124、miRNA-221在缺血性腦卒中患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 收集缺血性腦卒中患者85例的臨床資料，將腦卒中患者分為完全卒中組和進(jìn)展卒中組，選取同期本院健康體檢者38例為對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)血清miRNA-124、miRNA-221的表達(dá)。結(jié)果 腦卒中患者血清miRNA-124、miRNA-221表達(dá)與對(duì)照組比較分別上調(diào)和下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；miRNA-124在進(jìn)展卒中組的表達(dá)水平低于完全卒中組（t=21.37，P＜0.01），miRNA-221的表達(dá)水平則高于完全卒中組（t=22.26，P＜0.01）。完全卒中組和進(jìn)展卒中組miRNA-124、miRNA-221表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.687，-0.692，P＜0.01）。兩組患者中miRNA-124，miRNA-221的表達(dá)水平分別和甘油三酯、總膽固醇、收縮壓及空腹血糖具有相關(guān)性［（r=0.387，0.316，0.369，0.337，P＜0.01）；（r=0.-328，-0.368，-0.329，-0.382，P＜0.01）］。結(jié)論 檢測(cè)血清miRNA-124、miRNA-221表達(dá)可預(yù)測(cè)缺血性腦卒中疾病的發(fā)生及判斷其危險(xiǎn)程度，估計(jì)病情的發(fā)展?fàn)顩r。

缺血性腦卒中 miRNA-124 miRNA-221 完全性卒中 進(jìn)展性卒中

缺血性腦卒中的發(fā)病率約占腦卒中總數(shù)的60%～70%，其原因可能是由于頸內(nèi)動(dòng)脈和椎動(dòng)脈狹窄和閉塞引起，動(dòng)脈粥樣硬化是狹窄和閉塞的主要原因［1］。盡早恢復(fù)缺血腦組織的灌注及減輕腦組織的損傷，成為治療急性缺血性腦卒中的首要目標(biāo)［2］。miRNA 廣泛參與缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展過程，如動(dòng)脈粥樣硬化、腦水腫、缺血再灌注損傷等方面［3］。本文采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)缺血性腦卒中患者的血清miRNA-124、miRNA-221表達(dá)，探討缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取2014年1至10月本院收治的缺血性腦卒中患者85例；既往有高血壓病63例、糖尿病27例、冠心病16 例、長期大量吸煙 32 例。SSS評(píng)分（30.7±7.9）分。所有患者均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。患者發(fā)病時(shí)間＜24h，均為首次發(fā)病，并經(jīng)頭部CT或MRI檢查確診。排除心源性因素引起的卒中。依據(jù)病情分為完全卒中組和進(jìn)展卒中組。完全卒中組43例，男27例，女16例；年齡47～80歲，平均年齡（61.5±11.3）歲。進(jìn)展卒中組42例，男25例，女17例；年齡45～78歲，平均年齡（63.2±12.3）歲。選取同期本院健康體檢者38例為對(duì)照組，男24例，女14例；年齡45～79歲，平均年齡（60.2±10.7）歲。各組的性別和年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本項(xiàng)目經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法 （1）所有患者在發(fā)病后6h分別采集靜脈血，在＜2h作如下處理：4℃1500r/min離心10min，取上清液，4℃1500r/min，進(jìn)一步離心10min，將所得的血清標(biāo)本分裝于無RNA酶和DNA酶的凍存管中，-80℃保存。采用RT-PCR檢測(cè)血清中miRNA-124、miRNA-221的表達(dá)。（2）儀器、試劑和引物：采用mirVANA PARIS試劑盒提取總RNA。在冰上融化血漿，吸取100ml，加入等體積的變性液，渦旋混勻，在冰上孵育5min；再加入等體積的酸/酚/氯仿，渦旋混勻1min，冷凍離心5min，重復(fù)此步驟3次，再與1.25倍體積的無水乙醇充分混合，過柱，洗柱2次，將所得的RNA用緩沖液稀釋；再加葡萄糖和無水乙醇在-80℃沉淀，棄去上清液，將沉淀物在空氣中干燥2～3min，用無RNA酶水1μl溶解，相當(dāng)于100μl的血漿。每個(gè)樣品取3μl逆轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)體系如下：10μl 2×Taqman通用的PCR預(yù)混物，1μl 20×miRNA特異性引物，1.33μl cDNA，7.67μl水；95℃變性10min，95℃15s，60℃1min，50循環(huán)（每個(gè)樣品重復(fù)3次）。miRNA-124、miRNA-221表達(dá)量用Ct值變化表示。△Ct（HVCT）均值-（Xn）Ct，（HVCT）是所有健康志愿者Ct的平均值，Xn表示每個(gè)受試對(duì)象的Ct值。缺血性腦卒中與健康對(duì)照樣本相應(yīng)的miRNA的相對(duì)表達(dá)量為2-△ct。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件。計(jì)量資料用（x±s）表示，用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組腦血管危險(xiǎn)因素結(jié)果比較 完全卒中和進(jìn)展卒中組的甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、收縮壓（SP）及空腹血糖（FBG）分別與對(duì)照組比較均增高，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（t=12.33，17.61，11.73，9.21，P＜0.01）；（t=11.42，10.49，8.59，9.15，P＜0.01）］；兩卒中組的甘油三酯、總膽固醇水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.62，3.23，P＜0.01）。見表1。

表1　各組部分心血管危險(xiǎn)因素結(jié)果比較（x±s）

2.2卒中組miRNA-124、miRNA-221表達(dá)水平比較 完全卒中組和進(jìn)展卒中組miRNA-124表達(dá)量分別與對(duì)照組比較明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=36.55，13.87，P＜0.01）；完全卒中組和進(jìn)展卒中組miRNA-221與對(duì)照組比較明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=39.65，14.55，P＜0.01）； miRNA-124在進(jìn)展卒中組的表達(dá)量低于完全卒中組（t=21.37，P＜0.01），miRNA-221在進(jìn)展卒中組的表達(dá)量則高于完全卒中組（t=22.26，P＜0.01）。見表2。

表2　各組miRNA-124、miRNA-221水平比較（x±s）

2.3相關(guān)性分析 完全卒中組和進(jìn)展卒中組miRNA-124、miRNA-221表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.687，-0.692，P＜0.01），miRNA-124、miRNA-221的表達(dá)水平分別和甘油三酯、總膽固醇、收縮壓及空腹血糖具有相關(guān)性（r=0.387，0.316，0.369，0.337，P＜0.01）；（r=0.-328，-0.368，-0.329，-0.382，P＜0.01）。

3　討論

缺血性腦卒中的發(fā)生主要是由于顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成導(dǎo)致血管閉塞或斑塊破裂而引起血管栓塞［1］。研究證明血清中存在著穩(wěn)定的miRNA［4，5］，有報(bào)道認(rèn)為，miRNA-124在腦缺血24h后的大鼠血漿中表達(dá)明顯增高［6］，Weng等［7］研究認(rèn)為，miRNA-124 參與神經(jīng)元分化、神經(jīng)生長發(fā)育以及腦組織損傷后的調(diào)控，建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型，檢測(cè)其血漿miRNA-124水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腦缺血6h miRNA-124即開始升高，一直持續(xù)＞48h。通過檢測(cè)其表達(dá)協(xié)助診斷腦卒中的發(fā)生并有可能評(píng)估該疾病預(yù)后。本資料通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)缺血性腦卒中患者血清miRNA-124的基因表達(dá)，結(jié)果顯示兩卒中組miRNA-124表達(dá)較對(duì)照組均上調(diào)，提示缺血性腦卒中疾病的進(jìn)展受到miRNA-124表達(dá)的影響。完全卒中組miRNA-124水平較進(jìn)展卒中組上調(diào)更明顯，表明進(jìn)展性腦卒中患者腦血管內(nèi)可能存在血栓形成，完全性卒中組患者可能出現(xiàn)腦血管栓塞。提示miRNA-124可以作為缺血性腦卒中早期診斷評(píng)價(jià)的有效補(bǔ)充。

動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性腦卒中最主要的危險(xiǎn)因素，血管內(nèi)斑塊形成是動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，脂質(zhì)沉積等是斑塊形成的主要過程［3］。Albinsson等［8］研究認(rèn)為，在動(dòng)脈粥樣硬化患者中存在miR-221，miR-222，miR-126，miR-130a等調(diào)節(jié)失控，而這些miRNA由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。Tsai等［9］對(duì)人群小樣本腦血管病研究發(fā)現(xiàn)，外周血清的miRNA-221表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組，因此miRNA-221可以作為腦血管疾病的潛在標(biāo)志物。本資料結(jié)果也顯示，兩卒中組miRNA-221表達(dá)低于對(duì)照組，完全卒中組水平下調(diào)更明顯，提示缺血性腦卒中患者腦血管存在一定的損傷，完全卒中組患者較進(jìn)展卒中組損傷更嚴(yán)重，表明進(jìn)展性卒中患者腦血管內(nèi)可能存在斑塊形成，從而加大了卒中發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，完全卒中患者可能出現(xiàn)腦血管栓塞。因此，通過對(duì)miRNA-221的檢測(cè)，可作為缺血性腦卒中疾病的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后評(píng)價(jià)。

本資料結(jié)果顯示在缺血性腦卒中疾病兩病例組中血清miRNA-124和miRNA-221表達(dá)水平具有負(fù)相關(guān)性，其分別與甘油三酯、總膽固醇、收縮壓及空腹血糖也有相關(guān)性，提示兩標(biāo)志物參與了缺血性腦卒中疾病的病理發(fā)展，與該疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，聯(lián)合檢測(cè)血清miRNA-124和miRNA-221水平可預(yù)測(cè)缺血性腦卒中的發(fā)生，判斷其危險(xiǎn)程度，評(píng)估病情的發(fā)展?fàn)顩r。

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710061 陜西省西安市第八醫(yī)院檢驗(yàn)科（周曉冬 肖小平）712000陜西省咸陽市第一人民醫(yī)院康復(fù)科（郝瑞）