血清miRNA-124 miRNA-221在缺血性腦卒中的臨床應用

周曉冬 郝瑞 肖小平

血清miRNA-124 miRNA-221在缺血性腦卒中的臨床應用

周曉冬 郝瑞 肖小平

目的 探討血清miRNA-124、miRNA-221在缺血性腦卒中患者中的臨床應用價值。方法 收集缺血性腦卒中患者85例的臨床資料，將腦卒中患者分為完全卒中組和進展卒中組，選取同期本院健康體檢者38例為對照組。采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術檢測血清miRNA-124、miRNA-221的表達。結果 腦卒中患者血清miRNA-124、miRNA-221表達與對照組比較分別上調和下調，差異有統計學意義（P＜0.01）；miRNA-124在進展卒中組的表達水平低于完全卒中組（t=21.37，P＜0.01），miRNA-221的表達水平則高于完全卒中組（t=22.26，P＜0.01）。完全卒中組和進展卒中組miRNA-124、miRNA-221表達均呈負相關（r=-0.687，-0.692，P＜0.01）。兩組患者中miRNA-124，miRNA-221的表達水平分別和甘油三酯、總膽固醇、收縮壓及空腹血糖具有相關性［（r=0.387，0.316，0.369，0.337，P＜0.01）；（r=0.-328，-0.368，-0.329，-0.382，P＜0.01）］。結論 檢測血清miRNA-124、miRNA-221表達可預測缺血性腦卒中疾病的發生及判斷其危險程度，估計病情的發展狀況。

缺血性腦卒中 miRNA-124 miRNA-221 完全性卒中 進展性卒中

缺血性腦卒中的發病率約占腦卒中總數的60%～70%，其原因可能是由于頸內動脈和椎動脈狹窄和閉塞引起，動脈粥樣硬化是狹窄和閉塞的主要原因［1］。盡早恢復缺血腦組織的灌注及減輕腦組織的損傷，成為治療急性缺血性腦卒中的首要目標［2］。miRNA 廣泛參與缺血性腦卒中的發生、發展過程，如動脈粥樣硬化、腦水腫、缺血再灌注損傷等方面［3］。本文采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術檢測缺血性腦卒中患者的血清miRNA-124、miRNA-221表達，探討缺血性腦卒中的發病機制。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取2014年1至10月本院收治的缺血性腦卒中患者85例；既往有高血壓病63例、糖尿病27例、冠心病16 例、長期大量吸煙 32 例。SSS評分（30.7±7.9）分。所有患者均符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準。患者發病時間＜24h，均為首次發病，并經頭部CT或MRI檢查確診。排除心源性因素引起的卒中。依據病情分為完全卒中組和進展卒中組。完全卒中組43例，男27例，女16例；年齡47～80歲，平均年齡（61.5±11.3）歲。進展卒中組42例，男25例，女17例；年齡45～78歲，平均年齡（63.2±12.3）歲。選取同期本院健康體檢者38例為對照組，男24例，女14例；年齡45～79歲，平均年齡（60.2±10.7）歲。各組的性別和年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本項目經本院倫理委員會批準。

1.2方法 （1）所有患者在發病后6h分別采集靜脈血，在＜2h作如下處理：4℃1500r/min離心10min，取上清液，4℃1500r/min，進一步離心10min，將所得的血清標本分裝于無RNA酶和DNA酶的凍存管中，-80℃保存。采用RT-PCR檢測血清中miRNA-124、miRNA-221的表達。（2）儀器、試劑和引物：采用mirVANA PARIS試劑盒提取總RNA。在冰上融化血漿，吸取100ml，加入等體積的變性液，渦旋混勻，在冰上孵育5min；再加入等體積的酸/酚/氯仿，渦旋混勻1min，冷凍離心5min，重復此步驟3次，再與1.25倍體積的無水乙醇充分混合，過柱，洗柱2次，將所得的RNA用緩沖液稀釋；再加葡萄糖和無水乙醇在-80℃沉淀，棄去上清液，將沉淀物在空氣中干燥2～3min，用無RNA酶水1μl溶解，相當于100μl的血漿。每個樣品取3μl逆轉錄，PCR反應體系如下：10μl 2×Taqman通用的PCR預混物，1μl 20×miRNA特異性引物，1.33μl cDNA，7.67μl水；95℃變性10min，95℃15s，60℃1min，50循環（每個樣品重復3次）。miRNA-124、miRNA-221表達量用Ct值變化表示。△Ct（HVCT）均值-（Xn）Ct，（HVCT）是所有健康志愿者Ct的平均值，Xn表示每個受試對象的Ct值。缺血性腦卒中與健康對照樣本相應的miRNA的相對表達量為2-△ct。

1.3統計學方法 采用SPSS18.0軟件。計量資料用（x±s）表示，用t檢驗，相關性分析用Pearson 法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組腦血管危險因素結果比較 完全卒中和進展卒中組的甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、收縮壓（SP）及空腹血糖（FBG）分別與對照組比較均增高，其差異均有統計學意義［（t=12.33，17.61，11.73，9.21，P＜0.01）；（t=11.42，10.49，8.59，9.15，P＜0.01）］；兩卒中組的甘油三酯、總膽固醇水平比較差異均有統計學意義（t=5.62，3.23，P＜0.01）。見表1。

表1　各組部分心血管危險因素結果比較（x±s）

2.2卒中組miRNA-124、miRNA-221表達水平比較 完全卒中組和進展卒中組miRNA-124表達量分別與對照組比較明顯上調，差異有統計學意義（t=36.55，13.87，P＜0.01）；完全卒中組和進展卒中組miRNA-221與對照組比較明顯下調，差異有統計學意義（t=39.65，14.55，P＜0.01）； miRNA-124在進展卒中組的表達量低于完全卒中組（t=21.37，P＜0.01），miRNA-221在進展卒中組的表達量則高于完全卒中組（t=22.26，P＜0.01）。見表2。

表2　各組miRNA-124、miRNA-221水平比較（x±s）

2.3相關性分析 完全卒中組和進展卒中組miRNA-124、miRNA-221表達均呈負相關（r=-0.687，-0.692，P＜0.01），miRNA-124、miRNA-221的表達水平分別和甘油三酯、總膽固醇、收縮壓及空腹血糖具有相關性（r=0.387，0.316，0.369，0.337，P＜0.01）；（r=0.-328，-0.368，-0.329，-0.382，P＜0.01）。

3　討論

缺血性腦卒中的發生主要是由于顱內動脈粥樣硬化血栓形成導致血管閉塞或斑塊破裂而引起血管栓塞［1］。研究證明血清中存在著穩定的miRNA［4，5］，有報道認為，miRNA-124在腦缺血24h后的大鼠血漿中表達明顯增高［6］，Weng等［7］研究認為，miRNA-124 參與神經元分化、神經生長發育以及腦組織損傷后的調控，建立大鼠大腦中動脈阻塞模型，檢測其血漿miRNA-124水平，結果發現在腦缺血6h miRNA-124即開始升高，一直持續＞48h。通過檢測其表達協助診斷腦卒中的發生并有可能評估該疾病預后。本資料通過RT-PCR技術檢測缺血性腦卒中患者血清miRNA-124的基因表達，結果顯示兩卒中組miRNA-124表達較對照組均上調，提示缺血性腦卒中疾病的進展受到miRNA-124表達的影響。完全卒中組miRNA-124水平較進展卒中組上調更明顯，表明進展性腦卒中患者腦血管內可能存在血栓形成，完全性卒中組患者可能出現腦血管栓塞。提示miRNA-124可以作為缺血性腦卒中早期診斷評價的有效補充。

動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中最主要的危險因素，血管內斑塊形成是動脈粥樣硬化的標志，內皮細胞損傷，脂質沉積等是斑塊形成的主要過程［3］。Albinsson等［8］研究認為，在動脈粥樣硬化患者中存在miR-221，miR-222，miR-126，miR-130a等調節失控，而這些miRNA由血管內皮細胞產生。Tsai等［9］對人群小樣本腦血管病研究發現，外周血清的miRNA-221表達水平顯著低于健康對照組，因此miRNA-221可以作為腦血管疾病的潛在標志物。本資料結果也顯示，兩卒中組miRNA-221表達低于對照組，完全卒中組水平下調更明顯，提示缺血性腦卒中患者腦血管存在一定的損傷，完全卒中組患者較進展卒中組損傷更嚴重，表明進展性卒中患者腦血管內可能存在斑塊形成，從而加大了卒中發生的風險，完全卒中患者可能出現腦血管栓塞。因此，通過對miRNA-221的檢測，可作為缺血性腦卒中疾病的早期發現和預后評價。

本資料結果顯示在缺血性腦卒中疾病兩病例組中血清miRNA-124和miRNA-221表達水平具有負相關性，其分別與甘油三酯、總膽固醇、收縮壓及空腹血糖也有相關性，提示兩標志物參與了缺血性腦卒中疾病的病理發展，與該疾病的發生和發展密切相關。因此，聯合檢測血清miRNA-124和miRNA-221水平可預測缺血性腦卒中的發生，判斷其危險程度，評估病情的發展狀況。

1 陳孝平，汪建平.外科學.第八版.北京：人民衛生出版社，2013. 285～286.

2 劉競麗，秦超.缺血性腦卒中血液生物標志物的檢測及臨床應用.中華檢驗醫學雜志，2014，37（7）：497～500.

3 保玉蓮，朱榆紅.MicroRNA與缺血性腦卒中關系的研究進展.中國實用神經疾病雜志， 2014，17（4）：94～97.

4 Brase JC，Wuttig D，Kuner R，et al.Serum microRNAs as noninvasive biomarkers for cancer.Mol Cancer，2010，9：306.

5 Arroyo JD，Chevillet JR，Kroh EM .et al.Argonaute complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma .Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（12）：5003～5008.

6 林洋，芮耀誠.腦缺血大鼠腦組織及血漿中microRNA-124a表達的變化.中國腦血管病雜志，2011，8（3）：143～147.

7 Weng HC，Shen，GouHirokawa，et al.Plasma miRNA-124 as a biomarker for cerebral infraction.Biol Res，2011， 32（2）： 135～141.

8 Albinsson S，Sessa WC.Can microRNAs control vabcular smooth muscle phenotypic modulation and the response to injury.Physiol Genomicomplete stroke， 2011，43（10）：529～533.

9 Tsai YC，Wang YS，et al.Serum microRNA-21 and microRN-221as potential biomarkers for cerebrovascular disease.J Vasc Res，2013，50（4），346～354.

710061 陜西省西安市第八醫院檢驗科（周曉冬 肖小平）712000陜西省咸陽市第一人民醫院康復科（郝瑞）