羥乙基淀粉沉降法制備外周血富白細胞血漿的條件優化

史艷利 高嶺 張憲偉 李萌 陳紅兵

羥乙基淀粉沉降法制備外周血富白細胞血漿的條件優化

史艷利 高嶺 張憲偉 李萌 陳紅兵

目的 探討羥乙基淀粉（HES）沉降法制備外周血富白細胞血漿的最佳分離條件。方法 觀察外周血與 6 %的羥乙基淀粉混勻后靜止30 min、60 min及離心等不同處理后，計算其回收率。結果 6 %HES與外周血體積比為 1∶4時，白細胞回收率較高，比例增大至l∶1 及4∶1，回收率降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。6% HES與外周血體積比為1∶4、1∶1及4∶1時血小板的回收率差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 建立制備外周血富白細胞血漿的優化條件：6 %的HES沉淀外周血 60 min，HES與外周血的比例1∶4時，外周血白細胞及血小板的回收率最高。

羥乙基淀粉 富白細胞血漿 富血小板血漿

羥乙基淀粉（HES）可與紅細胞膜上的負電荷結合，使紅細胞凹面相貼而使得沉降速度加快，以HES為沉降劑可將紅細胞沉降分離去除。HES為沉降法目前在臍血分離中被廣泛采用［1］。實際臨床工作中，部分檢測項目要求外周血富白細胞及富血小板血漿，而短時間的高速離心常使白細胞下沉，本文探討HES沉降法制備外周血富白細胞血漿的最佳分離條件，現報道如下。

1　臨床資料

1.1外周血來源 外周血采集自本科室健康工作人員，肝素抗凝。6%HES為中國大冢制藥有限公司生產，主要化學成分為130/0.4，為氯化鈉復方制劑。

1.2沉降實驗 將6 % HES溶液與外周肝素抗凝血按一定體積比混勻，置于 5 m1肝素抗凝管自然靜置沉降，室溫靜置30min、60min及沉降60min后低速離心等不同操作后，比較白細胞及血小板的回收率。回收率的計算公式為：Recovery=Vu·Cu/（Vu·Cu + Vd·Cd）=（Vu/ Vs）·（Cu/Cs）。下層（Ld）主要為紅細胞團，包含少量白細胞，大部分白細胞集中在上層（Lu）段，取Lu段液體，計白細胞和總細胞數，Ld段的液體同樣作計數，并由此計算白細胞回收率。

1.3細胞計數 白細胞計數：用白細胞稀釋液進行稀釋（冰醋酸2ml，蒸餾水98 ml，10 g/L亞甲藍溶液3滴），混勻后過濾備用。血小板計數：用 10 g/L的草酸鈉溶液稀釋后，血細胞計數板進行計數。

2　結果

2.16 %HES溶液與全血不同體積比對白細胞回收率的影響 6 %HES與外周血體積比為1∶4時，白細胞回收率較高，比例增大到1∶1及 4∶1時，回收率降低。6 %HES與外周血體積比為 1∶4 時，沉淀60 min時，白細胞回收率最高，沉淀30 min時白細胞回收率次之，與沉淀60min比較，差異無統計學意義，P＞0.05。見表1。

表l HEs與外周血體積比、沉降間、沉降后離心白細胞回收率（%）

2.26%HEs溶液與全血體積比對血小板回收率的影響 相同處理條件下，6%HEs與外周血體積比為1∶4、1∶1及4∶1時PLT的計數差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2　HEs與外周血體積比、沉降時間、沉降后離心的血小板回收率（%）

2.36 %HEs與外周肝素抗凝血1∶4混勻對白細胞及血小板回收率的影響 選取30份標本，6 %HEs與外周肝素抗凝血1∶4混勻，白細胞及血小板回收率標本直接離心2800r/min離心2min后明顯低于其余各組，差異有統計學意義，P＜0.05。沉降60min白細胞的回收率高于其他各組，有顯著性差異（P＜0.05）。見表3。

表3　6%HEs與外周肝素抗凝血1∶4混勻，白細胞及血小板回收率（n=30）

2.4綜合上述結果以及各表結果，羥乙基淀粉沉降法制備外周血富白細胞血漿時，6 %HES與外周血體積比為1∶4時，且沉降時間為60min白細胞回收率較高。

3　討論

HES沉降法［2］在臍血分離中被廣泛應用，本文探討6%HES沉降法制備外周血富白細胞及富血小板血漿的條件優化，6%HEs為中分子羥乙基淀粉聚糖復合物［3，4］。HES沉降法外周血沉降過程是利用紅細胞團和白細胞的沉降速度的差異來實現分離。紅細胞團快速沉降而導致其周圍液體的向上運動，帶動了白細胞的向上運動，產生了對流現象［5，6］。本資料中HES溶液與全血體積比增大到1∶1及 4∶1 時，白細胞回收率降低，差異有統計學意義。6%HES與外周血體積比為1∶4，1∶4及4∶1時血小板的計數無差異。6 %HES與外周血體積比為1∶4時，且沉降時間為60min白細胞回收率較高，與郭繼強［7］報道結果一致。

臨床上短時間低速離心外周血常可以通過吸取中下層血漿來獲取富血小板血漿，而部分檢測指標在白細胞表面分布更廣，這就需要分離出富白細胞及富血小板血漿，通過本方法為臨床上需要用外周血中白細胞進行檢測的指標提供一個簡單優化的方法。

1 王穎超，殷楚云，馮磊，等.三種不同的方法分離臍血造血干細胞的效果比較 .實用兒科臨床雜志，2012，27（10）：766～768.

2 馬艷，陳雙，畢曉娟，等.羥乙基淀粉一步與兩步法分離骨髓單個核細胞及血小板比較.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（40）：7529～8432.

3 Bourzac C， Smith LC， Vincent P， et al. Isolation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells： a comparison between three protocols. Equine Vet J， 2010，42（6）：519～527.

4 Lapierre V， Pellegrini N， Bardey I，et al. Cord blood volume reduction using an automated system （Sepax） vs. a semi-automated system（Optipress II） and a manual method（hydroxyethyl starch sedimentation）for routine cord blood banking： a comparative study.Cytotherapy， 2007，9（2）：165～169.

5 遲占有，姜華，蔡海波，等.羥乙基淀粉沉降法分離臍血過程的深入分析及條件優化 .中國輸血雜志，2004，17（2）：71～74.

6 Davis RH，Acrivos A.Sedimentation of noncolloidal particles at low reynold numbers.Ann Rev Fluid Mech，1985，17（1）：91～118.

7 郭繼強，劉愛兵，沈丹.兩步法分離羥臍血單個核細胞的最佳條件 .中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（45）：8447～8450.

210008南京醫科大學附屬南京兒童醫院檢驗科