馬齒莧抗糖尿病活性成分的研究

金 妍，　徐華影，　陳 琛

（天津醫科大學第二醫院，天津　300211）

［成分分析］

馬齒莧抗糖尿病活性成分的研究

金 妍，徐華影，陳 琛

（天津醫科大學第二醫院，天津300211）

目的 研究馬齒莧抗糖尿病的活性成分。方法 馬齒莧全草用75%乙醇提取，利用硅膠、凝膠等柱色譜及制備液相色譜進行分離，并根據有機波譜技術鑒定了化合物結構，進一步通過測定各個化合物對胰島素抵抗的HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響以及黃酮苷類化合物對Akt磷酸化水平的影響來評價其抗糖尿病活性。結果 從馬齒莧中分離鑒定了9個化合物，分別為芹菜素-4′-O-α-L-鼠李糖苷（1），橙皮苷（2），山柰酚（3），木栓酮（4），6，7-二羥基香豆素（5），反式-對香豆酸（6），金蓮花堿（7），咖啡酸（8），二十八烷酸（9），此外化合物1～4能夠顯著提高胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗，其中化合物1的效果最為顯著并能降低該細胞Akt的磷酸化水平。結論 化合物1為首次從該植物中分離得到并且具有較強的抗糖尿病活性。

馬齒莧；黃酮苷；芹菜素-4′-O-α-L-鼠李糖苷；抗糖尿病活性

馬齒莧Protulaca oleracea L.又名馬齒草、長壽菜等，為馬齒莧科一年生肉質草本植物，廣泛分布于全世界溫帶和熱帶地區，是我國衛生部劃定的78種藥食同源的野生植物之一。性味酸寒，具有清熱解毒，涼血止血之功。現代藥理學研究表明馬齒莧具有降血脂、降血糖和抗動脈粥樣硬化等功能［1-2］。文獻報道其化學成分主要有生物堿、萜類、有機酸、黃酮、揮發油、香豆素和多糖等［2］。本實驗運用大孔吸附樹脂、硅膠柱色譜、凝膠柱色譜的方法從馬齒莧乙醇浸膏中分離鑒定了9個化合物，包括黃酮苷類化合物，香豆素類化合物，有機酸類化合物及三萜類化合物，其中化合物1為首次從該植物中分離得到，此外，本實驗對分離得到的黃酮苷類化合物進行了抗糖尿病活性的篩選，結果顯示化合物1具有較強的抗糖尿病活性。

1　儀器與材料

Bruker AV 400核磁共振儀（TMS內標）；JASCO半制備高效液相色譜儀（PU-2089，RI-2031，UV-2075，JASCO日本分光株式會社）；UV-3310型紫外-可見分光光度計（日本日立集團）；YMCPack ODS-A SH-343-5色譜柱（20 mm×250 mm，5μm）；A sahipak GS-20G H200142，H200143色譜柱（20 mm×500 mm，5μm）；柱色譜和薄層色譜用硅膠（青島海洋化工廠）；37℃，5%CO2細胞培養箱（力康生物醫療技術控股有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；全自動酶標板分析儀（美國伯樂公司）；倒置顯微鏡（奧林巴斯有限公司）；所用試劑均為分析純；氘代試劑（西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司）；含酚紅或不含酚紅DMEM培養液（北京四環科技公司）；胎牛血清（FBS），PBS（HyC1one）；葡萄糖試劑盒（上海榮盛生物藥業有限公司）；25%（含EDTA）胰蛋白酶（以色列生物工業公司）；胰島素（法國Li1y公司）HepG2細胞購自中科院上海細胞庫，Akt、p-Akt及Actin抗體（美國CST公司）。

馬齒莧Protulaca oleracea L.采自四川（2012年4月），由蘭州大學生命科學院及甘肅省食品藥品檢驗所共同鑒定為Protulaca oleracea L.，標本（D20120423）存放于天津醫科大學第二醫院藥劑科中藥房。

2　實驗方法

2.1提取分離 取自然干燥的馬齒莧全草10.0 kg，粉碎后用75%的乙醇加熱回流提取3次，每次6 h，提取液減壓濃縮，得浸膏900 g，將浸膏以水混懸，依次用水飽和的石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得石油醚提取物242 g，乙酸乙酯提取物125 g，正丁醇提取物138 g。3 kg馬齒莧石油醚提取物及1.5 kg乙酸乙酯提取物分別以硅膠柱層析（100～200目）分離，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇系統梯度洗脫，洗脫梯度為石油醚-乙酸乙酯（8∶1，6∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3），100%乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇（95∶5，90∶10，80∶20）和100%甲醇依次梯度洗脫，通過TLC合并類似組分，石油醚提取物分離得到26個組分（PA～PZ），乙酸乙酯提取物分離得到15個組分（EA～EO）。

組分PG經過凝膠滲透柱層析Toyopea1HW-40分離，二氯甲烷-甲醇（2∶1）洗脫，得到Fr. PG1～Fr.PG4，Fr.PG2（879.0 mg）再經制備高效液相色譜分離純化，分別得到化合物3（26.5 mg），化合物5（21.6 mg）；組分PK經過凝膠滲透柱層析Toyopea1 HW-40分離，二氯甲烷-甲醇（2∶1）洗脫，得到Fr.PK1～Fr.PK5，Fr.PK3（934.7 mg）再經制備高效液相色譜及制備薄層色譜法分離純化，分別得到化合物2（24.5 mg）和化合物6（11.0 mg）。組分EF經過凝膠滲透柱層析Toyopea1HW-40分離，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到Fr.EF1～Fr.EF4，Fr.EF2（1 256.3 mg）再反復經制備高效液相色譜法分離純化，分別得到化合物1（22.1 mg），化合物7（16.9 mg）。組分EH經過凝膠滲透柱層析Toyopea1HW-40分離，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到Fr.EH1～Fr.EH4，Fr.3（842.9 mg）再反復經制備高效液相色譜法及重結晶法分離純化，分別得到化合物4（34.2 mg），化合物9（15.1 mg）。組分EM經過凝膠滲透柱層析Toyopea1HW-40分離，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到Fr.EM1～Fr.EM6，Fr.PK4（921.4 mg）再經制備高效液相色譜及制備薄層色譜法分離純化，得到化合物8（20.5 mg）。

2.2胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗實驗 將處于對數生長期的細胞消化后，用含10%FBS的DMEM培養基調整細胞密度為105個/mL，轉入96孔板中。待細胞單層貼壁后，加入新配制的含有10-7mo1/L胰島素的培養液，并設無胰島素的空白孔，于37℃5%CO2培養箱中孵育36 h后棄去培養液，先用pH4.0的無酚紅的DMEM洗4次，再用無酚紅DMEM洗2次后，換上無血清的培養基37℃孵育24 h后，用葡萄糖臨床試劑盒檢測培養基的葡萄糖含有量。實驗分別設正常細胞組、胰島素抵抗模型組、化合物處理組（終濃度分別為1、5、10μmo1/L）。以不鋪細胞的空白孔為空白對照，計算24 h各組細胞的葡萄糖消耗量。根據初篩3個濃度下的葡萄糖消耗量重新設定5個濃度進行EC50值的測定，測定的數據經SPSS 11.0統計軟件系統進行統計學分析，以±s表示，組間差異的顯著性采用t檢驗方法進行，EC50的計算采用非線性擬合方法進行。

2.3磷酸化Akt及非磷酸化Akt蛋白水平的檢測

本實驗采用免疫印跡法（Western B1ot法），方法簡述如下：細胞加裂解液裂解后取上清，加入5X蛋白上樣緩沖液95℃沸煮5 min后在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳后轉移至PVDF膜上，然后用5%的脫脂牛奶封閉1 h，洗膜后將膜分割，分別加入Akt、p-Akt和β-actin的抗體，稀釋比例為1∶1 000稀釋，4℃過夜。再次洗膜后加入第二抗體進行反映，室溫孵育1 h，洗膜后ECL熒光顯色和曝光。利用圖像分析系統確定X線光膠片上蛋白條帶的相對灰度。

3　結果

3.1結構鑒定

化合物1：黃色粉末，mp 247～249℃。1HNMR（CDC13，400 MHz）δ：6.88（1H，s，H-3），6.21（1H，s，H-6），6.51（1H，s，H-8），8.04（2H，d，J=8.3 Hz，H-2′，6′），7.21（2H，d，J= 8.3 Hz，H-3′，5′），12.90（1H，br s，OH-5），5.54（1H，br s，H-1″），1.10（3H，d，J=6.1 Hz，H-6″）。13C-NMR（CDC13，100 MHz）δ：164.1（C-2），104.8（C-3），182.8（C-4），162.4（C-5），98.6（C-6），165.3（C-7），95.0（C-8），158.4（C-9），104.9（C-10），124.9（C-1′），129.3（C-2′，6′），117.7（C-3′，5′），160.0（C-4′），99.9（C-1″），71.0（C-2″），71.3（C-3″），72.7（C-4″），70.8（C-5″），18.9（C-6″）。以上光譜數據與文獻［3］報道基本一致，因此鑒定化合物1為芹菜素-4′-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物2：白色粉末，mp 286～287℃。1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：1.09（3H，d，J= 6.5 Hz，H-6?），5.52（1H，dd，J=3，12.5 Hz，H-2），2.77（1H，dd，J=3.0，17.0 Hz，H-3），3.27（1H，dd，J=12.0，17.0 Hz，H-3），3.79（3H，s，OCH3-4′），3～3.58（10H，糖上質子），4.54（1H，s，H-1?），4.95（1H，d，J=7.5 Hz，H-1″），6.15（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.18（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.93（3H，m，H-2′，5′，6′）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：78.5（C-2），42.2（C-3），197.2（C-4），163.3（C-5），96.6（C-6），165.5（C-7），95.8（C-8），162.8（C-9），100.7（C-10），130.9（C-1′），114.3（C-2′），148.1（C-3′），146.7（C-4′），112.3（C-5′），117.9（C-6′），55.8（C-7′），99.8（C-1″），73.1（C-2″），76.5（C-3″），70.5（C-4″），75.7（C-5″），66.2（C-6″），103.9（C-1?），70.9（C-2?），72.2（C-3?），69.8（C-4?），68.1（C-5?），17.9（C-6?）。以上光譜數據與文獻［4］報道基本一致，因此鑒定化合物2為橙皮苷。

化合物3：黃色粉末，mp 274～275℃。1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：12.45（1H，s，OH-5），8.08（2H，d，J=8.3 Hz，H-2′，6′），6.90（2H，d，J=8.3 Hz，H-3′，5′），6.38（1H，d，J= 1.8 Hz，H-8），6.17（1H，d，J=1.8 Hz，H-6）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：148.2（C-2），137.3（C-3），177.5（C-4），162.7（C-5），99.5（C-6），165.7（C-7），94.6（C-8），158.4（C-9），104.7（C-10），121.9（C-1′），130.8（C-2′，6′），115.5（C-3′，5′），160.8（C-4′）。以上光譜數據與文獻［5］報道基本一致，因此鑒定化合物3為山柰酚。

化合物4：白色針狀結晶（乙酸乙酯），mp 260～262℃。1H-NMR（CDC13，400 MHz）δ：0.74（3H，s，H-24），0.87（3H，s，H-25），0.89（3H，d，J=6.8 Hz，H-23），0.97（3H，s，H-30），1.00（3H，s，H-29），1.02（3H，s，H-26），1.05（3H，s，H-27），1.22（3H，s，H-28），2.3～2.4（2H，m，H-2）。13C-NMR（CDC13，100 MHz）δ：213.2（C=O），22.3（C-1），41.9（C-2），58.3（C-4），42.1（C-5），41.8（C-6），18.8（C-7），51.9（C-8），37.8（C-9），59.7（C-10），35.6（C-11），23.9（C-12），39.3（C-13），38.8（C-14），30.5（C-15），36.3（C-16），32.8（C-17），43.7（C-18），36.0（C-19），28.5（C-20），32.9（C-21），39.5（C-22），16.9（C-23），14.9（C-24），18.5（C-25），17.7（C-26），19.5（C-27），31.7（C-28），34.6（C-29），31.9（C-30）。以上光譜數據與文獻［6］報道基本一致，因此鑒定化合物4為木栓酮。

化合物5：淡黃色粉末，mp 269.5～270.5℃。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：6.19（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），7.79（1H，d，J=9.5 Hz，H-4），6.95（1H，s，H-5），6.77（1H，s，H-8）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：164.4（C-2），113.9（C-3），146.8（C-4），112.5（C-5），144.5（C-6），150.5（C-7），103.8（C-8），152.3（C-9），112.9（C-10）。以上光譜數據與文獻［7］報道基本一致，因此鑒定化合物5為6，7-二羥基香豆素。

化合物6：無色針晶，mp 170～172℃。1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.46（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6），6.76（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），7.60（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.29（1H，d，J=16.0 Hz，H-8）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：127.9（C-1），131.5（C-2，6），116.8（C-3，5），161.8（C-4），146.9（C-7），115.8（C-8），171.2（C-9）。以上光譜數據與文獻［8］報道基本一致，因此鑒定化合物6為反式-對香豆酸。

化合物7：無色片狀晶塊（甲醇），mp 165.0～167.0℃。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：1.61（1H，m，H-1），2.26（1H，m，H-2），2.41（1H，m，H-2），2.54（2H，m，H-6），2.59（1H，m，H-1），2.94（1H，m，H-5），3.98（1H，m，H-5），4.60（1H，t，J=7.8 Hz，H-10b），6.52（1H，s，H-7），6.54（1H，s，H-10）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：27.7（C-1），31.6（C-2），172.4（C-3），36.9（C-5），27.6（C-6），123.8（C-6a），115.7（C-7），144.3（C-8），144.5（C-9），112.0（C-10），128.7（C-10a），55.9（C-10b）。以上光譜數據與文獻［9］報道基本一致，因此鑒定化合物7為金蓮花堿。

化合物8：淡黃色粉末，mp 207～209℃。1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.05（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），6.77（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），6.95（1H，dd，J=2.0，8.2 Hz，H-6），7.50（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.18（1H，d，J=16.0 Hz，H-8）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：128.4（C-1），115.7（C-2），147.6（C-3），149.9（C-4），117.1（C-5），123.5（C-6），147.4（C-7），115.8（C-8），167.8（C-9）。以上光譜數據與文獻［10］報道基本一致，因此鑒定化合物8為咖啡酸。

化合物9：白色粉末，mp 90.5～91.0℃，不溶于無機酸，易溶于堿，推測為脂肪酸；EI-MS m/z87，101，115，129，157，171，185，213，227，255，297，311，325，339，353，367，424；與二十八烷酸對照品TLC的Rf值一致。其光譜數據與文獻［11］報道基本一致，因此鑒定化合物9為二十八烷酸。

3.2化合物對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗的影響 本實驗對分離得到的各個化合物進行了抗糖尿病的初步活性測定，利用胰島素抵抗的HepG2細胞為體外模型，測定化合物1～9對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響，結果如圖1所示，化合物1～4能夠有效地促進胰島素抵抗HepG2細胞的葡萄糖消耗，其中化合物1的作用最為顯著。根據初步活性結果，確定了EC50的濃度測定范圍，對化合物1進行了EC50濃度測試，測試濃度分別為（1μmo1/L、5μmo1/L、10μmo1/L、50μmo1/L、100μmo1/L），其EC50值為12.67μmo1/L。

3.3化合物1對胰島素抵抗HepG2細胞Akt磷酸化水平的影響 蛋白激酶B（Akt/PKB）是一種重要的蛋白激酶，參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的細胞過程，它在西部代謝、細胞周期調控、細胞生長凋亡等多種生物學過程中發揮著重要作用，與胰島素抵抗的發生發展密切相關［12］。本實驗利用胰島素抵抗的HepG2細胞，測定化合物1在濃度分別為1、5、10μmo1/L時對胰島素抵抗狀態下HepG2細胞蛋白激酶B（Akt/PKB）的磷酸化水平的影響，實驗結果如圖2所示，化合物1在不影響Akt總蛋白表達的前提下能夠顯著降低胰島素抵抗HepG2細胞Akt的磷酸化水平，并呈現劑量依賴性，顯示化合物1可能通過降低Akt磷酸化水平來改善HepG2細胞的胰島素抵抗狀態從而提高葡萄糖消耗，提示化合物1具有一定的抗糖尿病活性。

圖1　化合物1～9對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.1　Effect on gIucose consum ption of compounds1-9 in insu Iin resistance HepG2 ceIIs

4　討論

本實驗從馬齒莧石油醚和乙酸乙酯極性部位提取分離得到9個化合物，其中化合物1為首次從該植物中分離得到。根據馬齒莧的現代藥理學研究結果以及文獻報道黃酮及黃酮苷類化合物具有顯著的抗糖尿病活性［13-14］，利用胰島素抵抗HepG2細胞對化合物1～9進行抗糖尿病作用的初步篩選，初步篩選結果表明，黃酮類化合物1～4能夠有效地提高胰島素抵抗的HepG2細胞葡萄糖消耗量，其中化合物1的效果最為顯著；進一步對Akt磷酸化水平評價表明，化合物1能劑量依賴性的降低胰島素抵抗HepG2細胞Akt磷酸化水平，改善胰島素抵抗，提高細胞對葡萄糖的利用，顯示了明確的體外抗糖尿病作用。本實驗利用胰島素抵抗的HepG2細胞模型對馬齒莧的抗糖尿病活性進行了初步研究，為中藥馬齒莧的抗糖尿病應用提供了實驗依據。

圖2　不同濃度化合物1對胰島素抵抗HepG2細胞Akt磷酸化水平的影響Fig.2　Effect of compound 1 w ith different concentrations on the phosphoryIation IeveIof Akt of insu Iin resistance HepG2 ceIIs

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Anti-diabetic constituents of Portulaca oleracea L.

JIN Yan， XU Hua-ying， CHEN Chen
（The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China）

AIM To study the chemica1constituents from Portulaca oleracea L.and their anti-diabetic activity.METHODS The constituents extracted from P.oleracea with 75%ethy1a1coho1were iso1ated by chromatography of si1ica ge1，ODS，Toyopear1HW-40 and preparative HPLC.Their structureswere identified on the basis of the physica1properties and spectra1 ana1ysis.Furthermore，the anti-diabetic activities were eva1uated by g1ucose consumption assay and the effect on Akt phosphory1ation in insu1in-resistance HepG2 ce11s.RESULTS Nine compounds were iso1ated from P.oleracea L.and identified as apigenin-4′-O-α-L-rhamnopyranoside（1），hesperidin（2），kaempfero1（3），friede1in（4），6，7-dihydroxycoumarin（5），E-p-coumatic acid（6），tro11isine（7），caffeic acid（8），O ctacosanoic acid（9），and compounds1-4 had significant1y stimu1ated g1ucose consumption in insu1in resistance HepG2 ce11s，especia11y compound 1，and decreased their Akt phosphory1ation.CONCLUSION Compound 1 is iso1ated from P.oleracea L.for the first time and exhibits remarkab1e anti-diabetic activity.

Portulaca oleracea L.；f1avonoid g1ycoside；apigenin-4′-O-α-L-rhamnopyranoside；antidiabetic activity

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0124-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.025

2014-02-28

金 妍（1986—），女，藥師，從事藥房工作。Te1：13920294947，E-mai1：386831119@qq.com