不同黃芪劑量補陽還五湯對糖尿病大鼠周圍神經功能及氧化應激的作用

賁 瑩，　張鳳華，　梁文杰，　張 冬，　方 倩

（河北中醫學院中西醫結合學院，河北　石家莊　050200）

不同黃芪劑量補陽還五湯對糖尿病大鼠周圍神經功能及氧化應激的作用

賁 瑩，張鳳華，梁文杰，張 冬，方 倩

（河北中醫學院中西醫結合學院，河北石家莊050200）

目的 探討不同黃芪劑量補陽還五湯對糖尿病周圍神經病變大鼠周圍神經功能及氧化應激的作用。方法 用鏈脲佐菌素（STZ）誘導建立SD大鼠糖尿病周圍神經病變模型，并隨機分為模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組和α-硫辛酸組。黃芪60 g組和黃芪120 g組分別用含對應量黃芪的補陽還五湯濃煎劑灌胃，α-硫辛酸組用20 mg/（kg·d）α-硫辛酸灌胃。另設正常組。給藥12周后，檢測空腹血糖（FBG）、坐骨神經傳導速度，血中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）水平以及坐骨神經半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性。結果 與正常組相比，模型組的FBG、MDA水平和caspase-3活性明顯升高，坐骨神經傳導速度、SOD、CAT、GSH-Px的活力明顯下降（P＜0.01）。與模型組比較，黃芪120 g組和α-硫辛酸組MDA水平和caspase-3活性明顯下降，坐骨神經傳導速度、SOD、CAT、GSH-Px的活力明顯上升（P＜0.05，P＜0.01）；黃芪60 g組坐骨神經傳導速度、SOD、CAT的活力明顯上升，MDA水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。與黃芪60 g組比較，黃芪120 g組SOD活性顯著提高（P＜0.01）；神經傳導速度、CAT、GSH-Px活性有增高趨勢，MDA水平及caspase-3活性有減低趨勢，但差異無統計學意義。黃芪120 g組與α-硫辛酸組比較各指標無統計學差異。結論 補陽還五湯能有效減低糖尿病周圍神經病變大鼠的氧化應激反應，發揮其保護作用。120 g黃芪用量的補陽還五湯抗氧化作用略佳。

糖尿病周圍神經病變；氧化應激；補陽還五湯；黃芪

糖尿病周圍神經病變是常見的糖尿病慢性并發癥之一，發病率高達90%［1］，其發病機制尚未完全闡明，但大量研究表明氧化應激可以直接或間接地損傷神經細胞，在糖尿病周圍神經病變的發生中起到了重要作用［2-3］。中醫認為本病主要為絡氣虛滯，淤血阻絡［4］，臨床治法上我們應用補氣活血通絡的補陽還五湯加減治療取得了較好的療效。但對其能否通過改善氧化應激而減少周圍神經損傷，還缺少客觀實驗證據。本研究旨在觀察不同黃芪劑量補陽還五湯對糖尿病周圍神經病變大鼠氧化應激及周圍神經功能的作用，以期明確補陽還五湯方發揮治療作用的途徑、效果及方中黃芪的最佳劑量，以指導臨床用藥及科研。

1　材料

1.1動物 雄性SD大鼠60只，體質量180～220 g（2月齡左右），購自河北醫科大學實驗動物中心，單位許可證號SYXK（冀2008-0026）；動物合格證號1301053。

1.2藥物 補陽還五湯原方來源《醫林改錯》，黃芪120 g，當歸6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g，簡稱黃芪120 g組。另設黃芪60 g，其余藥物劑量不變，簡稱為黃芪60 g組。以上兩組藥物分別加水浸泡2 h，水煎2次，每次40 min，先后兩次藥液合并、濃縮，分別制成含生藥2.4、1.36 g/mL的藥液。α-硫辛酸購于Puritan's Pride公司（100 mg×60粒，批號：250597-09 EXP 10/12）。

1.3試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購于Sigma公司；微量丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（g1utathion peroxidase；g1utathione peroxidase，GSH-Px）測試盒購于南京建成生物工程研究所；大鼠半胱天冬酶3（caspase-3）酶聯免疫檢測試劑盒構于BG公司

1.4儀器 One touchII型血糖儀（美國強生公司）；DANTEC Cantata肌電圖誘發電位儀；島津紫外分光光度計UV-1700，pharmaSpec SHIMADIU。

2　方法

2.1分組、建立動物模型 60只SD大鼠按體質量相似隨機分為5組，正常組、模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組、α-硫辛酸組，每組10只。在禁食12 h后模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組、α-硫辛酸組大鼠予一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后大鼠禁食8 h測鼠尾靜脈血，血糖≥16.7 mmo1/L確立為糖尿病大鼠模型，正常對照組大鼠注射等量的檸檬酸緩沖液。

2.2給藥 造模成功立即開始灌胃，黃芪60 g組、黃芪120 g組按10 mL/（kg·d）分別用相應黃芪量藥液灌胃；α-硫辛酸組按20 mg/（kg·d）用α-硫辛酸灌胃；正常組和模型組給予等體積的蒸餾水。實驗期間自由飲食，連續給藥12周。

2.3觀察指標

2.3.1坐骨神經傳導速度測定 給藥結束后，水合氯醛麻醉大鼠，用肌電圖儀檢測大鼠右側坐骨神經傳導速度［5］。以坐骨窩為第一刺激部位，踝部為第二刺激部位。均經皮插入2個針電極，間距為2 mm，尾部接地，保持皮溫30℃。（1）運動神經傳導速度（MCV）：方形波刺激神經，用2個針電極于同側足部骨間肌，記錄復合肌肉動作電位及潛伏期。檢測3對不同M波的潛伏期，取平均值。兩個刺激部位間的傳導時間為近端、遠端潛伏期差，測量兩個刺激部位間的距離。運動神經傳導速度（m/s）=距離/潛伏期差值。（2）感覺神經傳導速度（SCV）：方形波記錄6對在坐骨窩和踝激發的H反射潛伏期，測量兩個刺激部位間的距離。感覺神經傳導速度（m/s）=距離/潛伏期差值。

2.3.2血液指標測定 每月1次尾靜脈采血，血糖儀測定空腹血糖（FBG）；給藥結束取血，比色法測定SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA水平。

2.3.3坐骨神經caspase-3活性檢測 給藥結束后，腹腔注射烏拉坦麻醉大鼠，分離雙側坐骨神經，迅速取下，用預冷的0.9%氯化鈉溶液洗去雜質和血漬，濾紙吸干，在-196℃液氮中保存。按試劑盒說明用酶聯免疫吸附法測定Caspase-3活性。

2.4統計學分析 采用SPSS 11.0統計軟件處理數據，檢測結果±s表示，組間均數比較采用方差分析和SNK法兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1　不同時間點各組大鼠空腹血糖及坐骨神經傳導速度（±s，n=10）

表1　不同時間點各組大鼠空腹血糖及坐骨神經傳導速度（±s，n=10）

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空腹血糖/（mmo1·L-1）4周8周12周MCV/（m·s-1）SCV/（m·s-1）正常組4.96±0.63△△5.02±0.58△△4.87±0.51△△45.26±4.35△△46.45±7.12△△模型組26.54±3.77 25.83±4.14 26.10±3.81 30.17±5.16 29.21±9.38黃芪60 g組27.21±3.26 26.36±3.52 25.97±2.72 35.82±6.36△37.06±6.74△黃芪120 g組26.25±3.89 25.74±3.16 24.16±3.05 37.32±6.22△40.17±5.22△△α-硫辛酸組26.12±4.02 26.27±3.35 26.14±3.44 36.79±7.08△39.55±6.38△

3　結果

3.1空腹血糖變化 模型組、黃芪120 g組、黃芪60 g組、α-硫辛酸組FBG顯著高于正常組。黃芪120 g組FBG略低于模型組，但差異無統計學意義。見表1。

3.2各組坐骨神經傳導速度的比較 與正常組比較，模型組坐骨神經MCV和SCV明顯減慢（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪60 g組、黃芪120 g組和α-硫辛酸組MCV和SCV明顯提高（P＜0.05），其中黃芪120 g組SCV增高更明顯（P＜0.01）；三藥物干預組間比較無統計學差異。見表1。

3.3各組氧化指標及caspase-3活性的變化 模型組比正常組SOD、GSH-Px、CAT活性均明顯下降（P＜0.01），MDA水平、caspase-3活性明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪60 g組MDA水平降低（P＜0.05），SOD活性上升（P＜0.01）CAT水平升高（P＜0.05）；黃芪120 g組及α-硫辛酸組SOD、GSH-Px、CAT活性均上升（P＜0.01），MDA水平、caspase-3活性顯著降低（P＜0.01）。三藥物干預組間比較黃芪120 g組與α-硫辛酸組SOD活性較黃芪60 g組升高（P＜0.01），其余指標無統計學差異。見表2。

表2　各組大鼠血液SOD、GSH-Px、CAT活性、MDA及坐骨神經caspase-3活性比較

4　討論

糖尿病周圍神經病變是糖尿病主要的慢性并發癥，其發病機制目前尚未完全明了，一般認為與多元醇通路、己糖胺途徑、蛋白激酶C途徑的激活和糖基化終產物的形成、微血管病變、氧化應激反應等諸多因素有關［6-7］。其中氧化應激在周圍神經病變中的作用受到了越來越多的重視。Brown1een［8］提出的統一機制學說認為，經典的糖尿病并發癥的多元醇途徑、糖基化終產物（AGES）途徑、蛋白激酶C（PKC）途徑和氨基已糖途徑均是高糖條件下線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過多導致的結果。氧化應激在糖尿病并發癥發生中處于核心的角色。氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitro-gen species，RNS）產生過多，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷。糖尿病高血糖狀態導致ROS和RNS生成增多，氧化應激反應增加［9］。一方面，氧自由基可攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，并因此形成脂質過氧化產物。神經髓鞘中含有大量脂類，體外試驗表明在坐骨神經組織勻漿中加入20 mmo1/L葡萄糖，使脂質過氧化物增加超過4倍［10］。脂質過氧化產物的最終產物為MDA。脂質過氧化作用可放大ROS的作用，交聯核酸、蛋白質及磷脂，也可使蛋白質巰基氧化，引起神經細胞進一步損傷［11］。另一方面，氧化應激反應可直接引發單鏈DNA的斷裂，或通過JNK、P38信號轉導通路誘導雪旺細胞中一系列半胱天冬酶激活，介導細胞凋亡的發生［12-13］。其中caspase-3在死亡受體和線粒體介導的經典細胞凋亡途徑中均起著核心作用。由此可見氧化應激反應是糖尿病周圍神經病變發病的重要機制，目前臨床應用抗氧化劑α-硫辛酸治療糖尿病周圍神經病變，取得了較好療效［14-15］。

本實驗結果顯示，補陽還五湯有與α-硫辛酸近似的作用，可使糖尿病周圍神經病變大鼠神經傳導速度增高，提升體內抗氧化劑SOD、GSH-Px、CAT活性，而使MDA水平及caspase-3活性明顯下降，提示補陽還五湯能有效減低糖尿病周圍神經病變大鼠的氧化應激損傷，發揮其保護作用。

補陽還五湯為清代醫家王清任所創，配伍用量特點為君藥黃芪劑量是其他活血通絡藥總和的5倍，《醫林改錯》中寫到“黃芪用一二兩，以后漸加至四兩”，重用黃芪旨在令氣旺血行而瘀去絡通。為進一步探討補陽還五湯配伍中重用黃芪的科學內涵，確定黃芪的最佳劑量，我們在實驗中設置了黃芪60 g組和黃芪120 g組進行對比，結果顯示黃芪60 g組與模型組比較神經傳導速度、SOD、CAT活性均顯著增高，MDA水平顯著下降。黃芪120 g組與模型組比較除上述指標有如上變化外，GSH-Px活性顯著增高，caspase-3活性明顯下降。但不同黃芪劑量組間比較，除黃芪120 g組SOD活性較60 g組顯著提高外，神經傳導速度、GSH-Px、CAT活性有增高趨勢，MDA水平及caspase-3活性有減低趨勢，但差異無統計學意義。以上結果說明使用60 g黃芪的補陽還五湯就已經顯示了較強的抗氧化作用，增大黃芪劑量可使其抗氧化效果略有增強，臨床治療時推薦按王清任原方120 g黃芪用量使用。

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R285.5

B

1001-1528（2015）01-0199-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.043

2013-11-01

河北省教育廳科學技術研究青年基金項目（QN2014019）

賁 瑩（1979—），女，碩士，講師，研究方向：中西醫結合神經病學。Te1：13315989821，E-mai1：benyfortunate@sohu.com