一種可快速感受機械力的傳感器細胞的理論設計方案

張英昊

【摘 要】本文利用了兩類可對細胞所受機械力進行響應并介導鈣離子從細胞外流入胞質的鈣離子通道，從理論上設計一種可響應所受機械力并迅速將機械力轉換成適當頻率和強度的熒光信號的傳感器細胞?；诖朔N理論基礎，研究了胞質鈣離子異常升高誘導的細胞凋亡的兩條信號通路。可以敲低或敲除鈣凋亡途徑中的相關分子，抑制機械力刺激產生的鈣離子內流誘發的凋亡作用，從而可以使傳感器細胞穩定傳代。

【關鍵詞】機械力；傳感器；細胞；融合蛋白

生物發酵工程中最常用的工程細胞是各種細菌，放線菌，真菌，酵母等微生物。但是生產一些具有較多轉錄后修飾的代謝物質，如干擾素，各種細胞因子，糖蛋白，激素等，則不能使用微生物，因為微生物缺乏相關的修飾功能，生產出的物質往往沒有活性。因此必須使用動物細胞。而動物細胞由于對環境比較敏感，比較難在大型生物反應器中培養。而難以在反應器中培養的一個原因是缺乏能直接反映細胞生理狀態的參數的檢測。眾所周知，生物反應器的標準檢測參數是溫度，ph，融氧，以及攪拌器轉速。但是以這些有限的物理、化學參數來對應于細胞內復雜而眾多的生理狀態，顯然是無法精確反應實際情況的，尤其是對環境比較敏感的動物細胞，往往是當細胞中眾多的實際生理狀態已經發生了劇烈變化，使細胞生長不佳甚至大量死亡后，上述的物理，化學參數才會有變化。因此，發酵中僅靠參數本身往往不能精確判斷發酵狀態，而是要依賴于操作者的經驗。

為了能夠解決這個問題，筆者考慮設計一種起傳感器作用的細胞，它與用于合成代謝物質的細胞一同在生物反應器中培養，享受相同的環境。但是這種傳感器細胞是經過改造的，它們能夠將由于外界環境變化而導致自身內部發生改變的生理信號，直接轉化成可被檢測裝置感受的特定的物理或化學信號，為生物反應器上相應的控制軟件提供精確信息，從而對影響細胞生理狀態的微環境進行精確檢測，并利用即時的反饋調節對生物反應器參數進行精確控制。

而本論文研究的是機械力對動物細胞的影響。由于動物細胞沒有細胞壁，對機械力是非常敏感的。然而動物細胞的生長及代謝物的合成都依賴氧氣，在生物反應器中為了實現供氧，必須依賴于培養基的不斷流動，翻滾，攪拌，這往往會產生變化劇烈的剪切力，損害細胞。因此，供氧和對剪切力的控制是一對矛盾體，必須平衡考慮。如果能培養出一種能感受所受機械力以及機械力對自身生理狀態的影響，并迅速將其轉變成特定頻率的光信號的傳感器細胞，必然對供氧和受力的控制這一過程提供很大幫助。

綜上所述，本論文根據已有的研究內容，從理論上設計一種滿足如上要求的，可感受機械力的傳感器細胞，并提出每一步驟中筆者能想到的可能的處理方法。

1 鈣離子通道感受機械力的機制研究

哺乳動物體內在生理條件下有很多種感受機械力的途徑，典型如細胞粘附與胞外基質，其粘附產生的力調控細胞的分化與凋亡；血管內皮細胞與胞外基質粘附，當血液流速過快或血管腔過窄時（即高血壓狀態），內皮細胞可感受力的狀態，從而促使合成舒張血管的NO前列腺素等物質[1]。經過大量研究，人們公認這些能感受機械力的細胞表面有能夠介導胞外鈣離子內流的trp家族離子通道，這些鈣離子通道介導了機械刺激時胞質內鈣離子的升高。但是，需要進一步研究trp家族感受機械力的具體機制。

研究表明，用含有RGD的磁珠處理細胞，再加磁場，使磁力作用于整合素上，發現力作用于整合素上時細胞膜顯示出了很大的剛性，即抵抗形變，同時細胞核的形狀發生了改變；相對的，用磁珠偶聯抗原肽，再加磁場，使力作用于MHC時，細胞膜顯示出了柔性，而且細胞核的形狀未發生改變。他們認為機械力通過整合素，傳給了在胞內與整合素相連的細胞骨架，再由細胞骨架傳遞給細胞核，從而引起細胞核形狀變化以及調控基因的表達。而MHC由于沒有與細胞骨架相連，故受力時細胞膜顯示出了柔性。同時，機械力刺激胞外基質ECM，產生與直接力刺激整合素相同的效果。這些研究闡明了機械力傳導的一種基本模式，即：

機械力刺激——ECM——整合素——細胞骨架——調控生理狀態

另外一些研究顯示，用機械力刺激間充質干細胞（刺激方式為使用光鑷為偶聯在整合素上的小珠施加力），會引起細胞質內鈣離子的明顯升高。胞質升高的鈣離子有兩個來源，一個是從胞外流入的，一個是從胞內的內質網流出而進入細胞質的（在胞外無鈣的環境中，向細胞處理內質網上的鈣離子通道抑制劑，發現對機械力刺激不會引起胞質鈣離子上升）。該研究組發現位于細胞膜上的介導胞外鈣離子流入胞質的是trp家族離子通道trpm7。他們研究了細胞骨架扮演的作用：在無IP3時，在胞外無鈣環境中，用細胞骨架解聚劑處理，發現內質網無法釋放鈣離子到胞質；而抑制內質網鈣通道，在胞外有鈣環境中，解聚細胞骨架，發現胞外鈣離子也無法流入。這些研究說明了trpm7和內質網上的IP3receptor鈣通道對機械力的響應機制正式通過整合素和細胞骨架作用的。事實上，另有文獻表明IP3r是直接與細胞骨架相連的。他們研究了trpm7和IP3r響應機械刺激所需的時間：在機械刺激細胞上的整合素后，胞外鈣離子流入胞內的平均時間是機械刺激后20秒，而內質網釋放鈣離子的平均時間是機械刺激后100秒。對于這一反應時間的差異，該研究小組認為是機械力沿著細胞骨架向細胞深處的內質網傳遞時，細胞骨架要通過一些方式重構來積累足夠強度的力學信號，這導致了內質網的鈣離子延遲釋放。

綜上，細胞對機械力的感受可分為ECM整合素、細胞骨架依賴性的胞質鈣離子上升和非依賴型的胞質鈣離子上升。ECM依賴性的機械力傳導機制可制作傳感器細胞用于對錨定依賴性細胞的培養，如作為血管內皮細胞生產前列腺素這一生產體系的傳感器細胞，大致的策略就是適當調整整合素和胞外基質和trpm7離子通道的表達量，實現鈣離子濃度對機械力刺激的最佳響應。不過由于胞內鈣離子的上升分別來自胞外和內質網，而內質網釋放鈣離子，響應速度較慢且與細胞膜流入鈣離子的響應時間差距較大（一個100秒一個20秒），所以從鈣離子信號即時性和整齊性的角度考慮，可以敲除或下調內質網上的IP3r鈣離子通道。而ECM非依賴性的Yvc1p鈣離子通道，可用于可懸浮培養的動物細胞的生產體系，比如培養巨噬細胞生產干擾素以及白介素等細胞因子。

2 由胞質鈣離子變化的生理信號向可檢測的光學信號的轉化

生物體中可檢測的光學信號最容易想到的就是熒光蛋白。比較容易想到的一類生理狀態轉化為光學信號的方式是通過一系列信號轉導過程調控熒光蛋白的表達量的變化，從而改變亮度。這些調控轉錄的途徑研究成果非常多，比如camp-creb途徑、CaM CaN NFAT途徑、Nf-kapa b途徑等等。但是改變熒光蛋白的表達量必須走轉錄翻譯過程，而這個過程無疑是很耗費時間的，通常情況下，在多種信號通路中，適當的信號刺激引起的某種分子的表達量的變化，至少也要五到六個小時才會有明顯差異。因此基因表達量調控的方式雖然適合開發藥物，但是與細胞傳感器即時性的要求是不符合的。故鈣離子向光信號轉化，只能依賴化學反應。

鈣離子成像，最常用的是一種叫fura-am的染料，該染料是脂溶性的，能透過細胞膜，然后被酯酶分解形成不透膜的fura留于胞內，與鈣離子定量結合，發射熒光。但是這種染料必須人為加入細胞，而無法讓細胞自己產生。而在實際的生產系統中是不可能嚴格區分生產細胞和傳感細胞的，若統一加入染料，由生產細胞產生的胞內鈣熒光，可以想象，會是一種強烈的背景干擾。因此，最好還是只對傳感細胞進行改造。

根據前人的研究結果，可以使用一種融合的熒光蛋白。該熒光蛋白利用了熒光共振轉移（FRET）原理。事先已大量表達于細胞質中，在為結合與結合鈣離子時會擁有不同的構象，在未結合鈣離子時發青光，結合時發紅光。根據這兩種頻率光的強度的比值，可以精確探測出胞內鈣離子的濃度。而且這種探測是幾乎即時的，因為不涉及轉錄翻譯，僅僅是由于鈣離子出現導致的構象變化。

3 排除胞質鈣離子濃度上升介導的細胞凋亡的影響

細胞凋亡是一種相對比較溫和的過程，不發生炎癥反應[2]。細胞凋亡上游的影響因素很多，涉及多種不同的信號級聯反應。但它們有共同的下游途徑，即激活bax/bak蛋白二聚化，定位于線粒體膜，使線粒體膜通透性喪失，內容物流出；然后凋亡又分為caspase 依賴和非依賴途徑，其中依賴途徑研究較清楚，即線粒體釋放的細胞色素c和apaf-1，與胞質中caspase9，形成復合體，并激活caspase3，誘導凋亡。而非凋亡途徑則由線粒體釋放的凋亡誘導因子（aif）引發，具體機制尚不清楚。凋亡的最終途徑是染色體斷裂成小碎片，與細胞器聚集在一起后，被表達有磷脂酰絲氨酸作吞噬信號的質膜包裹成小球，被臨近細胞識別吞噬。由于細胞凋亡總伴隨著凋亡小體形成，因此可以用TUNNEL實驗，來定量化反應細胞凋亡程度，這也是下面的文獻中的凋亡程度的評價方法。

而根據已有的研究[3]，胞質鈣離子的異常升高，是誘導細胞凋亡的一個重要因素。而我們的傳感器細胞感受機械力的原理就是胞質鈣離子升高，因此必須對細胞感受鈣離子的凋亡通路進行研究，并削弱這一通路。在正常細胞中，由腫瘤壞死因子結合死亡受體，激活caspas8，從而切割bid為t-bid（truncated bid），t-bid與線粒體上的bak/bax結合，在線粒體上形成孔道，促使線粒體內容物釋放誘發凋亡。而在胞質鈣離子升高時，鈣離子會激活鈣蛋白酶calpain，calpain可在bid的gly70和arg71之間切割形成t-bid（這里使用了gst-pull down方法，分離切割后的片段，在進行末端測序得到切割位點），進而促使細胞凋亡。

而另一條鈣離子介導的凋亡通路也被發現，即正常時磷酸化的Bad蛋白與14-3-3蛋白結合維持細胞存活狀態，這種bad的磷酸化是由多種上游信號通路介導的其中的兩個例子是mapk家族的mekk和蛋白激酶B（即akt）[4]；鈣離子激活鈣調蛋白磷酸酶（CaN），使其去磷酸化，與14-3-3蛋白解離；解離后Bad與Bcl2-bak復合體作用，置換出游離的bak；游離的bak二聚化，暴露bak的N末端（該末端可作為抗原表位，能夠以熒光抗體的方法衡量bak的促凋亡活化程度），然后插入線粒體膜，形成孔道釋放內容物，誘發凋亡。用calpain的抑制劑處理細胞，在測量二聚化的bax的量，發現bax的表達量不受影響，這進一步證實了鈣離子引發的bid被切割誘發凋亡和bad被磷酸化誘導的凋亡分屬兩條不同的途徑。然而，后來又有研究表明，在缺失bak/bax，只有t-bid的存在不會使線粒體通透性喪失，而只有bak/bax沒有t-bid時bax能轉位與線粒體但沒有通透線粒體的作用，推測與bax同源的bak也有相同的效果。因此t-bid是bax/bak促凋亡的激活劑[4]。4 結論

根據上述文獻的結果進行歸納總結，可得出鈣離子介導的細胞凋亡的通路如圖1：

因此，如果要制作傳感器細胞，可以考慮敲除bid 敲除bax/bak calpain CaN，或者可以用低效率的啟動子下調這些基因的表達。

如上便是可感受機械力的傳感器細胞的簡要設計方案。

相信隨著生物產業的發展以及對生物發酵產品的品質要求不斷提高，適應于動物細胞發酵條件的精確控制的傳感器細胞會大有用武之地。在必要的時候，可以考慮引入一些特定的支架分子，它們能夠將細胞感受缺氧和營養缺乏的上游信號，不通過經典的調控轉錄翻譯途徑，而是將其引向一種人為設計的或者與經典途徑不相干的，可快速反應的新途徑，即對細胞進行信號通路的嫁接和改造。當然，研發能夠快速感應生理信號并將其轉變為特定可檢測的物理化學信號的生物傳感分子（比如本文中使用的熒光探針）也是必不可少的。

【參考文獻】

[1]范一菲，孔德虎，等.血管內皮依賴性超極化因子的研究進展[J].中國臨床藥理學與治療學，2006（10）.

[2]翟中和，王喜忠，丁明孝.細胞生物學[M].高等教育出版社，2011.

[3]Colleen Tagliarino，John J，Pink.Caicium is a key signal molecule in β-lapachone-mediated cell deat[J].

[4]白莉，曹傳平，張映輝，毛高平.促凋亡蛋Bid誘導肝細胞凋亡機制[J].中國生物化學與分子生物學報，2004.

[責任編輯：侯天宇]