組織干細胞的培養及定向分化實驗

邵志華， 許 潔， 沙繼宏， 呂立夏， 徐 磊，李 姣， 賈 松， 李思光

(同濟大學a.醫學院干細胞研究中心;b.醫學與生命科學實驗教學中心，上海 200092)

0 引言

科學思維能力和解決問題的能力是全球醫學教育的基本要求之一，也是我國進行素質教育與卓越醫師培養的目標之一[1-3]。而實驗教學能促進學生發現問題、解決問題素質的形成，引導他們養成科學思維和團結協作精神，因此是培養學生創新能力和實踐能力的有效途徑[4-5]。隨著實驗教學改革的推進，高校的實驗教學已經突破了傳統單一的實驗模式，建立了綜合型、設計型和開放型等多種形式的實驗，充分發揮了實驗教學培養學生創新能力和實踐能力的作用[6-7]。細胞培養作為醫學研究中普遍應用的基本技術，目前已經被廣泛應用于醫學本科及研究生的實驗教學，其在一定程度上促進了學生綜合素質的培養[8-10]。然而，目前的細胞實驗教學還有許多不足之處。如在實驗方法方面，往往為孤立的實驗或多個實驗拼合而成，割裂了一般科學實驗的過程。在實驗內容方面，常常注重經典，缺乏經典與前沿的結合;注重基礎，缺乏基礎與臨床實踐的結合;注重傳承，缺乏科研成果的轉化教學。

干細胞(Stem Cells，SC)是一類具有自我更新及分化潛能的細胞，在疾病的細胞治療和器官移植方面有著巨大的醫學應用潛力，是世界醫學界研究的熱點[11-12]。因其重大的理論意義和無可估計的實際價值，高校特別是醫學院校應積極開展干細胞教學[13]。隨著干細胞研究熱潮的興起[14]，同濟大學成立了干細胞研究中心和臨床轉化中心，取得了一些研究成果，特別是在干細胞的培養及分化方面積累了一些經驗。

針對目前細胞實驗教學中存在的問題，結合本校的辦學定位和專業特色，我們設計并開展了“組織干細胞的培養及定向分化”的實驗教學，并在醫學院5年制和7年制本科生開展。該實驗為一個完整的科學實驗，能使學生親歷科學實驗的全過程，在實驗中培養學生的科研思維能力和解決問題的能力，對學生了解科學發展動態，掌握前沿科學知識和實驗技能具有重要意義。

1 實驗項目的設計與實施

1.1 組織干細胞的選擇

根據細胞來源，干細胞分為胚胎干細胞和組織干細胞。雖然胚胎干細胞具有萬能性，能分化為幾乎所以的組織細胞，但是因其來源于胚胎，具有倫理問題。而組織干細胞存在于成人各種組織和器官，不存在倫理問題。骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs)是一群來源于骨髓的組織干細胞，因其分離方法簡便，體外可大量擴增，細胞存活率高，便于自體移植及調控，在特定的誘導條件下可分化為多種細胞，如骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞等優點，在細胞治療及組織再生及修復等方面具有廣闊的應用前景[15]。鑒于此，我們選擇骨髓間充質干細胞作為實驗對象。

在誘導分化方面，考慮脂肪細胞誘導分化時間短(7～11 d)，分化效率高(80% ～90%)，容易鑒定(油紅O染色10 min)等優點[16-17]，所以我們選擇BMSCs誘導分化為脂肪細胞并用油紅O染色鑒定。

1.2 實驗安排及流程

本實驗的內容包括原代培養、傳代培養、定向分化和脂肪細胞染色鑒定。為了培養學生良好的科學習慣和團隊合作精神，實驗分組進行(2個同學一組)，每次實驗完畢后進行實驗記錄，包括細胞培養記錄和實驗結果記錄。具體安排如下(見圖1):

第1次，分離骨髓間充質干細胞，原代培養，37°C培養48 h。

第2次，觀察細胞形態及密度，傳代培養，37°C培養4～6 h后，更換誘導分化培養基，37°C繼續培養72 h。

第3次，觀察細胞形態、密度及生長特點，換液，37°C培養72 h。

第4次，油紅O染色鑒定，統計分化效率。

圖1 實驗安排及實驗流程

1.3 實驗考核體系

實驗考核是教學過程中的一個重要環節，為了取得良好的效果，對實驗過程和結果進行綜合考核并給出合理的成績，是有效地提高教學質量的保證。一種“全過程-多方式-立體化”的評價體系，能確切、客觀、全面地評定學生的學習能力[18]。因此，我們從以下4個環節全面考核學生，以達到促進實驗教學效果的目的。具體考核內容如下:

(1)動手參與程度和團隊合作精神。通過有效的團隊協作，培養學生溝通和交流的能力。

(2)實驗數據記錄和結果。規范實驗記錄，設計細胞培養實驗記錄表，要求每次觀察細胞后進行拍照，并及時對結果進行描述。目的是培養學生科學、嚴謹的科學態度及數據信息的管理能力。

(3)實驗過程中出現的故障處理。要求以學生為主體，教師為指導的原則，通過學生自主學習、自主分析，最終自主解決問題。達到調動學習的積極性和主動性，形成好的學習方法和習慣，培養其發現問題及解決問題的能力。

(4)實驗報告完成情況。要求小組撰寫實驗論文，分析實驗結果，以達到培養學生分析和整理數據的能力。

2 實驗建設效果

2.1 實驗項目安全、穩定、可行

經過嘗試和摸索，建立了以細胞培養為主線，組織干細胞培養為特色的綜合性實驗項目，編寫了實驗指導，進行了相關的預實驗，并在臨床醫學5/7年制本科生中連續開展了3年，每組均可獲得分化的脂肪細胞(見圖2)，效率穩定在60% ～80%左右。實驗使用的BMSCs來源于生物安全級大鼠，不涉及倫理問題，沒有生物安全隱患。實驗不涉及強腐蝕、毒性試劑和具潛在危險的儀器。因此，此實驗項目安全、穩定、可行。

圖2 BMSCs的培養及脂肪細胞的誘導分化

2.2 實驗項目為綜合型實驗

以往的細胞培養實驗教學往往為孤立的實驗或多個實驗的拼合，缺乏系統性、連續性和完整性，不能真實地體現科學實驗的過程。為了培養學生的科研能力，適應當代醫學生的培養目標，我們設計了此綜合實驗項目，具有系統性、連續性和完整性。

實驗是以細胞培養為中心的綜合實驗，涉及組織干細胞的分離和原代培養，細胞傳代培養，干細胞的分化和組織化學檢測4項基本實驗技術及分子生物學、生物化學、組織化學等方面的理論知識。采用原代培養—傳代培養—定向分化—細胞鑒定4個連續的實驗，實驗過程與實際的科學研究一致，為一個完整的科學實驗過程，具有系統性、連續性和完整性。由于4個實驗內容環環相扣，需要學生認真地完成每一個實驗，直至獲得最終的結果，因此增加了學生的動腦、動手機會，有利于培養學生的科研思維能力及基本實驗技能，為學生的科研能力的培養打下較為堅實的基礎。

2.3 實驗項目體現了經典與前沿的結合

以前的細胞培養實驗常常是用傳統的細胞系進行的，如Hela或293細胞，未能與科學發展的前沿結合，不利于學生掌握先進的實驗知識和技能。

建設的實驗項目是進行組織干細胞的培養、分化和鑒定，而干細胞因其重大的理論意義和無可估計的實際價值，目前成為世界科學界研究的熱點，因此，本實驗項目在最經典的細胞培養實驗的基礎上，結合前沿理論知識和實驗技能，既傳承了經典，又跟上時代的發展，與培養新時期高素質和創新人才的需要相一致。對于學生了解科學發展的動態，掌握前沿科學知識和實驗技能具有重要意義。

2.4 實驗項目體現了科研成果的轉化教學

組織干細胞因其具有多分化潛能，在創傷修復、細胞替代治療、基因治療等方面具有很好的臨床應用價值和廣闊的應用前景，是目前世界性課題，也是項目所在的教學團隊主要從事研究的課題之一。其中，骨髓來源的間充質干細胞(BMSCs)分化為脂肪細胞的研究取得了較好的研究成果，分化的脂肪細胞成熟度高、重現性好、難易程度適中，適合轉化為實驗教學項目[19]。實驗項目在教學中的順利實施證明了科研成果的轉化可使實驗教學內容緊跟學科技術的發展，充分體現了實驗教學是實現科研成果向教學內容轉化的主要途徑[19-20]。

3 結語

細胞培養為具有百年歷史的經典細胞生物學實驗技術，在醫學教育中具有重要的作用。而干細胞具有十分誘人的臨床應用前景，是當今世界研究的熱點。因此，干細胞的培養、分離、分化和鑒定是當代醫學生應該了解和掌握的實驗技能。

實驗項目在經典的細胞培養基礎上，結合前沿理論知識和實驗技能，既使學生掌握了基礎實驗技能，又使學生了解學科發展的方向，使學生跟上時代的發展，體現了實驗項目的前沿性與前瞻性，這與培養新時期高素質和創新人才的需要相一致。

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