花生中一個NBS—LRR類基因的克隆和表達分析b

趙小波等

摘要：本研究利用同源克隆方法，根據已知植物抗病（R）基因保守結構域設計一對簡并引物，采用RT-PCR方法對花生抗旱品種J11進行擴增，獲得了一個通讀的NBS-LRR類基因片段，命名為PDR1。PDR1長度為474 bp，核苷酸比較分析表明，PDR1與已克隆的大豆抗性基因（XM006573278）相似性為75%，與豌豆（AF123699）、苜蓿（XM003604518）抗性基因的相似性為74%；生物信息學預測其全長CDS編碼框為5 838 bp，編碼的蛋白質含1 945個氨基酸，含有NB-ARC等保守結構域。熒光定量PCR分析表明，PDR1基因在花生幼苗根、莖、葉中均有表達，相對表達量為葉>根>莖；干旱脅迫后PDR1的相對表達量在12 h達到頂峰，隨后下降，趨于平穩。本研究從花生中成功獲得了NBS-LRR類基因的同源序列，為篩選新的抗旱花生種質提供了理論依據。

關鍵詞：花生； NBS-LRR；同源序列；基因克隆；表達分析

中圖分類號：S565.2：Q781文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2015）05-0001-06

Cloning and Expression Analysis of a NBS-LRR

Resistance Gene in Peanut

Zhao Xiaobo1， Zhang Tingting1， Yan Caixia1， Zhang Hao1，2， Shan Shihua1*， Chen Dianxu1*

（1.Shandong Peanut Research Institute， Qingdao 266100， China； 2.Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

AbstractIn this study， one resistance gene homology fragment was isolated from peanut by homology cloning method. A pair of degenerate primers was designed according to the conserved domains of the known plant disease resistance genes， and then， the fragment with continuous open reading frame was obtained from the peanut variety J11 with drought tolerance by RT-PCR. The sequence was named PDR1. The length of PDR1 was 474 bp. The homology research results showed that the nucleotide of PDR1 was 75% identical to a cloned Glycine max resistance gene （XM006573278）， and 74% identical to the sequences from Pisum sativum （AF123699） and Medicago truncatula（XM003604518）， respectively. By bioinformatics method， it was predicted that the CDS of PDR1 was 5 838 bp， encoding 1 945 amino acids and containing the conserved domain of NB-ARC. The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that PDR1 expressed in peanut root， stem and leaves. The relative expression in different organs was leaves > root > stem. After drought stress， the relative expression of PDR1 in J11 reached the peak on the 12th hour， then decreased and moved towards stabilization. The obtain of this resistance homology sequence provided theoretical basis for the screening of drought resistant germplasms form peanut.

Key wordsPeanut； NBS-LRR； Homology sequences； Gene clone； Expression analysis

我國是世界花生生產大國，2007～2013連續6年總產量增加，達到1 700×104 t，占世界花生總產的40%以上，居世界第一位，2012年出口14.6萬噸，出口金額一直保持在2億美元以上。但是，花生產業的進一步發展受到旱災的威脅，據統計我國每年因干旱引起的減產達30%～50%。除減產外，干旱還有可能導致花生黃曲霉毒素污染、品質下降等一系列后果。所以，選育抗旱、高產、優質花生品種是花生育種工作的重要方向之一。

研究花生的抗旱機制是花生抗旱育種的基礎，目前一些NBS-LRR類基因被認為在花生抗旱過程中起到一定的作用。NBS-LRR類基因（nucleotide binding site-leucine-rich repeat）是R基因（抗病基因， resistance genes）中最大的類群，其蛋白產物含一個NBS和一個LRR結構域，NBS結構域具有4個高度保守的基序。目前，大多數NBS-LRR類基因是根據植物抗病基因保守序列結構特點設計引物擴增基因組DNA或cDNA獲得的。僅國內，就已在水稻、擬南芥、毛果楊、大豆和小麥等植物中成功擴增了許多抗病基因同源片段。在花生NBS-LRR類基因研究領域，Yuksel等做了大量的工作，取得了重要的成果，他的團隊設計了4對簡并引物和2對特異引物，總計獲得了234個具有開放閱讀框的NBS-LRR類基因片段；晏立英等利用已知的NBS保守區域設計引物，從中花6號中獲得了5條具有連續ORF的抗病基因序列。但是，相對于植物基因組中的NBS-LRR類基因數量，目前已知的該類基因數目仍然較少，需要設計新的引物或采用其他方法去獲得。endprint

本研究根據已克隆的植物抗病基因NBS-LRR保守結構域，參考已有研究成果設計簡并引物，從花生品種J11的cDNA中獲得抗病基因同源序列，并進行同源性比較及功能驗證，為今后花生抗旱種質的篩選奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料與處理

供試花生材料抗旱品種J11、不耐旱品種JH1012為山東省花生研究所提供，試驗所用材料為當年田間種植樣品。取飽滿一致的高活力花生種子各10粒，放在滅菌培養皿中置于人工培養箱，使用Hoagland營養液。人工培養箱培養條件設置為：27℃，光照強度2 000 lx，光照周期為16L∶8D。培養10天后取新鮮葉片，用液氮速凍，并保存于-80℃冰箱待用。

對27℃正常培養的J11花生幼苗進行15% PEG 6000溶液模擬干旱處理，分別取處理前（0 h）及處理后6、12、18 h和24 h幼苗第1片復葉；同時采集正常狀態J11花生幼苗的莖、根、葉，液氮速凍后于-80℃保存，用于熒光定量PCR分析。試驗設3次重復。

1.2葉片總RNA的提取和cDNA第一鏈合成

總RNA提取采用楊晨等的方法，略有改進。用紫外分光光度計（AA-680，日本島津） 檢測RNA濃度并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。cDNA第一鏈的合成采用Vazyme的HiScript第一鏈cDNA合成試劑盒。

1.3NBS-LRR類基因片段獲得

根據NBS類抗病基因編碼的蛋白質保守區域P-loop和GLPL設計一對簡并引物，引物序列見表1。以花生抗旱品種J11、不耐旱品種JH1012的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。反應體系為20 μL，包含10×PCR buffer 2 μL，MgCl2 （25 mmol/L）1.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，Taq（0.5 U/μL）0.2 μL，引物（10 mmol/L）各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O補足至20 μL。反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，40個循環；最后72℃延伸10 min。

1.4測序與序列比較

測序委托南京金絲瑞生物技術公司完成。序列數據首先與GenBank中已有序列信息進行比對。然后利用ClustalW軟件對測序數據進行人工對齊排序。選擇Kimura 2-parameter公式計算遺傳距離。并在MEGA6.0中采用鄰近法（Neighbor-Joining， NJ）構建系統樹，自舉值Bootstrap為1 000次重復。

1.5熒光定量RT-PCR分析

根據擴增得到的序列，用Prime 5.0設計熒光定量PCR特異引物，分別為YG1： 5′-TCACGACAAGAGATAGAAG-3′； YG2： 5′-TCCAGCATAAGCAACTACAT-3′，以花生肌動蛋白基因（actin）為內參基因，引物序列為Actin-F： 5′-GAGGAGAAGCAGAAGCAAGTTG-3′；Actin-R： 5′-AGACAGCATATCGGCACTCATC-3′。在7500FAST熒光定量PCR儀（ABI公司）上對花生干旱脅迫的葉片，以及正常狀態根、莖、葉目的基因表達情況進行分析。反應條件為 95℃ 10 s； 95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40個循環；繪制溶解曲線，溫度每10 s升高0.5℃。

2結果與分析

2.1花生NBS-LRR類基因片段分離與同源片段的聚類分析

根據NBS-LRR類基因保守結構域設計一對簡并引物S1、S2，對反轉錄合成的cDNA進行擴增，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在J11中獲得部分條帶（圖1），參考已有研究經驗，選取其中一條約500 bp的條帶進行回收，克隆測序（在JH1012中未獲得該片段）。經測序，該片段為一條通讀序列，長度為474 bp，命名為PDR1。

2.2PDR1的生物信息學分析

利用花生全基因組相關數據（未公布）找到PDR1所在的一個基因組contig，將相關信息輸入GENSCAN網站（http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html），預測其全長CDS編碼框。預測結果顯示，PDR1全長CDS編碼框為5 838 bp，編碼的蛋白質含1 945個氨基酸，其中丙氨酸87個，占4.47%；半胱氨酸28個，占1.44%；天冬氨酸116個，占5.96%；谷氨酸137個，占7.04%；苯丙氨酸85個，占4.37%；甘氨酸113個，占5.81%；組氨酸47個，占2.42；異亮氨酸141個，占7.25%；賴氨酸132個，占6.79；亮氨酸222個，占11.41%；蛋氨酸38個，占1.95；天冬酰胺84個，占4.32%；脯氨酸51個，占2.62%；谷氨酰胺79個，占4.06%；精氨酸111個，占5.71%；絲氨酸170個，占8.74%；蘇氨酸82個，占4.22%；纈氨酸142個，占7.30%；色氨酸24個，占1.23%；酪氨酸56個，占2.88%。

通過DNAMAN軟件預測出PDR1編碼蛋白的分子量大小為221.248 kD、等電點為7.02。由TMpred程序預測PDR1編碼蛋白質的跨膜結合區域，發現由內到外、由外到內的跨膜區域均為13個（圖3）。根據NCBI上的Conserved Domain Search，發現該蛋白含有NB-ARC等保守結構域（圖4）。

2.3PDR1基因表達分析

通過熒光定量PCR分別檢測花生品種J11根、莖、葉以及干旱脅迫下葉中PDR1的表達情況。從圖5中可以看出，正常情況下，PDR1基因在花生根、莖和葉中均有表達，其中葉中的相對表達量顯著高于根（P<0.05），莖中的相對表達量最低。endprint

干旱脅迫之后葉中PDR1的表達情況見圖6。0～12 h，基因的相對表達量處于上升階段，與對照（0 h）相比，6 h的相對表達量達顯著差異（P<0.05），12 h的表達量達極顯著差異（P<0.01），在12 h達到頂峰，隨后下降，18 h與24 h之間無顯著差異（P>0.05），處于平穩表達階段。

3討論與結論

NBS-LRR類基因是目前發現的最重要的抗性基因，現有的工作已經證明根據保守結構域設計引物進行同源序列的克隆是可行的。本研究所獲得的PDR1基因片段與已知NBS-LRR類基因具有較高的相似性，也證明了這一點。目前的許多工作是從基因組DNA中克隆該類基因，但是由于基因組DNA含有內含子，相對復雜，因此分離的NBS-LRR類基因可能有一些是不表達的假基因。魏芳等從小麥基因組中克隆了NBS-LRR類基因，經鑒定43個陽性重組子中有11個為假基因。Yuksel等利用花生基因組克隆NBS-LRR類基因，獲得了1 028條克隆序列，但是其中只有234個通讀序列。還有研究顯示，擬南芥中發現的149個NBS-LRR類基因中12條是假基因；水稻中存在約500個NBS-LRR基因，其中超過100條被認為是假基因。因此，在今后的工作中，應使用RT-PCR的方法進行同源克隆，以避免假基因的干擾。

NBS-LRR類基因通常分為兩大類，即TIR類和nonTIR類。TIR類N端為人白細胞介素1和果蠅的Toll樣受體（即TIR）結構，如煙草的N抗性基因。nonTIR類N端為亮氨酸拉鏈結構，如番茄抗根結線蟲病基因Mi。Meyers等認為，含有TIR的NBS-LRR類基因蛋白Kinase-2最后一個氨基酸殘基通常為天冬氨酸（D），也可以是任意氨基酸；而nonTIR為色氨酸（W）。PDR1基因Kinase-2最后一個氨基酸為天冬氨酸（D），可認為是TIR類。本研究獲得的PDR1基因全長是通過生物信息學方法預測得到的，而不是通過試驗手段，如RACE。本研究過程中也曾試圖利用RACE技術獲得全長，然而卻極其困難。同時，NCBI上相似度較高長度在4 500 bp以上的基因，除已經完成全基因組測序的苜蓿之外也全是預測序列，可見，較長序列的全長獲得在世界范圍內也是一個難題。PDR1基因全長的獲得需要在接下來的工作中尋找新的方法，逐步獲得。

我國有70%面積的花生受到不同程度的干旱危害，干旱脅迫可以顯著影響花生出苗、生長、開花、產量及品質等。篩選花生抗旱重要基因，是通過基因工程技術培育高產抗逆花生種質的基礎。雖然花生基因組測序已經取得重要進展，基因組已公布（http：//peanutbase.org/genomes），但尚有大量工作未完成，已公布的數據無法直接應用，對于許多基因，研究者仍然知之甚少，因此同源基因的功能表達研究仍是花生逆境脅迫研究工作的重要組成部分。本研究對PDR1在干旱脅迫后不同時間點的表達情況進行了分析，總體趨勢表現為先上升后下降，最后趨于穩定。PDR1是NBS-LRR類抗性基因，可能與花生的抗逆性相關。從本研究的結果來看，初始階段，基因表達量上升，表明PDR1開始應答干旱環境，參與花生抗旱過程，隨后下降并趨于穩定，但仍高于初始階段相對表達量，表明該基因已適應干旱環境，平穩表達。因此推測，PDR1基因的功能可能與花生抗旱性相關。

本研究為發現新的NBS-LRR類基因提供了資源，并且為下一步克隆PDR1基因全長、篩選新抗旱花生種質提供了理論依據。

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