基于SSR標(biāo)記構(gòu)建白蠟種質(zhì)資源分子身份證

胡春龍等

摘要：以山東省林業(yè)科學(xué)研究院壽光試驗(yàn)站收集的46份白蠟為試驗(yàn)材料，對(duì)白蠟種質(zhì)資源分子身份證的構(gòu)建進(jìn)行探究。利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)白蠟試材進(jìn)行區(qū)分，從150對(duì)引物中篩選出11對(duì)SSR引物對(duì)選定白蠟試材進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)引物可以檢測(cè)到3～5個(gè)基因型，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出2.52條帶和2.09條多態(tài)性帶，平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率為82.93%。將11對(duì)引物及其檢測(cè)出的等位基因依次賦值，構(gòu)建了供試白蠟種質(zhì)資源的分子身份證，能夠達(dá)到區(qū)分各品種的目的。

關(guān)鍵詞：白蠟；SSR；分子身份證

中圖分類號(hào)：S687.1∶Q781文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2015）05-0006-05

Establishment of Molecular ID for Fraxinus

Germplasms Based on SSR Markers

Hu Chunlong1， Zhang Chen1， Liu Cuilan2，3， Li Li2，3，

Yan Liping2，3， Wu Dejun2，3， Xia Yang2，3， Xing Shiyan1， Wang Kaifang2*

（1.College of Forestry， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China； 2.Shandong Academy of Forestry，

Jinan 250014，China； 3.Shandong Provincial Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement， Jinan 250014， China）

AbstractUsing 46 Fraxinus materials from the Shouguang Experimental Station of Shandong Academy of Forestry， the establishment of molecular ID for Fraxinus germplasms was studied. These Fraxinus materials were distinguished by SSR markers. Eleven pairs of primers screened from 150 pairs were used to amplify the selected Fraxinus materials. The results showed that 3～5 genotypes could be detected by each primer. The average number of bands and polymorphic bands were 2.52 and 2.09 amplified by every pair of primers. The average polymorphic loci percentage was 82.93%. After assignment of 11 pairs of primers and their alleles， the molecular IDs were established for the tested Fraxinus germplasms， which could well distinguish the varieties of Fraxinus.

Key wordsFraxinus velutina Torr； SSR； Molecular ID

白蠟（Fraxinus sp.）屬雙子葉植物綱，木犀科（Oleceae），木犀亞科（Oleoideae）。目前發(fā)現(xiàn)的白蠟約有70多種，在我國(guó)已見約34種。白蠟樹耐鹽堿、干形出眾，作為一種常見綠化樹種，在我國(guó)分布廣泛。由于白蠟種質(zhì)資源種類繁多，品種的鑒定引起研究者廣泛關(guān)注。20世紀(jì)80年代末，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)（SSR）的不斷發(fā)展和完善為白蠟種質(zhì)資源分子層面的鑒定奠定了基礎(chǔ)。

SSR微衛(wèi)星標(biāo)記分布比較均勻、穩(wěn)定性較高、重復(fù)性好且多態(tài)性豐富，在擬南芥等植物中的編碼區(qū)、非編碼區(qū)均廣泛存在，為種質(zhì)資源的純度及品種真實(shí)性鑒定提供理論依據(jù)。近年來(lái)，部分學(xué)者通過(guò)SSR技術(shù)在荔枝、黑核桃等植物上取得一定進(jìn)展，并成功構(gòu)建了大豆、香蕉、甘蔗、梨和桃等種質(zhì)資源的分子ID。然而到目前為止，SSR標(biāo)記技術(shù)在白蠟上還鮮有應(yīng)用。本研究利用SSR標(biāo)記技術(shù)，以山東省林業(yè)科學(xué)研究院壽光試驗(yàn)站保存的46份白蠟為試材，運(yùn)用相關(guān)軟件進(jìn)行分析，通過(guò)分子層面的研究，以期為探究構(gòu)建白蠟種質(zhì)分子身份證的方法提供理論依據(jù)，為白蠟新品種的審定、DUS測(cè)試、分子標(biāo)記輔助育種等奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選用山東省林業(yè)科學(xué)研究院壽光試驗(yàn)站收集保存的46份白蠟為試材（表1）。

1.2白蠟基因組DNA提取

取白蠟試材的新鮮葉片置于-50℃保存，采用改進(jìn)CTAB法提取白蠟基因組DNA。

1.3DNA檢測(cè)方法

將提取的白蠟基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)EB染色后在紫外燈下拍照，檢測(cè)是否有DNA條帶。利用微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量，將DNA按1∶50稀釋，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物的合成與PCR反應(yīng)

SSR引物為山東省林業(yè)科學(xué)研究院通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)合成的白蠟特異性引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)體系為10 μL，包含：Mg2+（25 mmol/L）0.1 μL、正反向引物（10 μmol/L）各1 μL、模板DNA（10 ng/μL）為1 μL，Taq酶（5 U/μL）5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至10 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過(guò)固定、銀染、漂洗、顯影等步驟后獲得相應(yīng)的指紋圖譜，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)后通過(guò)軟件進(jìn)行分析。endprint

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)所得的指紋圖譜對(duì)應(yīng)的分子量統(tǒng)計(jì)，依次記錄為數(shù)字1、2、3、…、m，統(tǒng)計(jì)軟件采用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的Genetics Statistics 3.0 （登記號(hào)為2007SR11872）、IDAnalysis 1.0，分別用于引物的多樣性指數(shù)、shannon多樣性指數(shù)（I）的分析和白蠟試材分子身份證的構(gòu)建。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA提取

由圖1可以看出，DNA條帶較亮，說(shuō)明提取的白蠟基因組DNA純度較高，符合試驗(yàn)基本要求。

2.2多態(tài)性引物的篩選

多態(tài)性高的引物可以更清晰地展示不同染色體上的信息，在46份試材中隨機(jī)選取10個(gè)白蠟品種對(duì)150對(duì)引物進(jìn)行篩選，得到11對(duì)條帶清晰、特異性較強(qiáng)的引物。

2.3引物等位基因信息分析

利用篩選出的11對(duì)引物對(duì)46份白蠟DNA依次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

根據(jù)擴(kuò)增得到的指紋圖譜分析得知：平均每對(duì)引物擴(kuò)增出2.52條帶和2.09條多態(tài)性帶，平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率為82.93%。每對(duì)引物可以檢測(cè)到3～5個(gè)等位基因，引物多樣性指數(shù)介于0.486～0.879之間，平均為0.606。其中，等位基因數(shù)大于平均值的引物有：Y132、Y064、Y077、Y082、Y124、Y083、Y112、Y093；多樣性指數(shù)高于平均值（4.6）的引物有：Y132、Y150、Y112（見表2）。Shannon多樣性指數(shù)（I）的變化范圍在0.9717～1.4017，平均為1.1996，說(shuō)明供試的白蠟屬群體中存在較高的遺傳多樣性。

2.4白蠟品種的分子身份證構(gòu)建

分子身份證的構(gòu)建方法一般有兩種，一種是以特異等位基因進(jìn)行區(qū)分，另一種是以多個(gè)引物的等位基因組合區(qū)分。結(jié)果顯示，利用Y132、Y064、Y077、Y082、Y124、Y123、Y150、Y083、Y112、Y093、Y120這11對(duì)引物可將供試品種進(jìn)行區(qū)分（表3）。

例如，表3中構(gòu)建的“白蠟1號(hào)”分子身份證為11001311441， 表示在對(duì)應(yīng)的引物順序下，第1個(gè)引物的第1個(gè)等位基因，第2個(gè)引物的第1個(gè)等位基因，第3個(gè)引物顯0個(gè)等位基因， 并依此類推， 到第11個(gè)引物的第1個(gè)等位基因?yàn)橹梗?由這些引物擴(kuò)增出的特異等位基因組成的指紋圖譜就可以代表相應(yīng)品種的分子身份證。引物的等位基因數(shù)越多，引物在資源鑒別中的作用就越大。引物的多樣性指數(shù)越高，它能區(qū)分品種的能力就越強(qiáng)。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從150對(duì)引物中篩選出11對(duì)，這些引物的多態(tài)性好且穩(wěn)定性高。多樣性指數(shù)高、特異性強(qiáng)的引物，可以廣泛用于分子身份證的構(gòu)建。許多研究者在統(tǒng)計(jì)時(shí)通常忽略指紋圖譜中的雜合帶型，采用微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增出的一個(gè)等位基因位點(diǎn)用于分子身份證的構(gòu)建，而本研究參考了陳昌文等的方法，編碼時(shí)只取指紋圖譜中較小的譜帶，通過(guò)增加引物的方法構(gòu)建有效分子身份證，使白蠟種質(zhì)資源的區(qū)分能力大幅度提升。目前有些研究者采用的編碼方式是數(shù)字加字母的組合方式，本研究使用純數(shù)字表示等位基因位置的方法，直接將對(duì)應(yīng)引物的指紋圖譜按照相應(yīng)的順序進(jìn)行數(shù)字編碼，由此得到的分子身份證更為簡(jiǎn)潔明了。

依據(jù)大麥系指紋圖譜對(duì)親本及其子代的SSR分析得知，SSR在不同世代之間的遺傳性狀具有穩(wěn)定性、連續(xù)性。在同一品種中，不同個(gè)體的SSR穩(wěn)定性在水稻等物種中也得以證實(shí)。因此，利用SSR構(gòu)建分子身份證具有準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)單快速、易于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，然而該方法也有其局限性。有研究者在利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建桃的分子身份證時(shí)，由于桃的親緣關(guān)系非常接近，難以達(dá)到區(qū)分的目的。有關(guān)分子身份證的試驗(yàn)證實(shí)，SSR技術(shù)可以有效區(qū)分來(lái)自同一育種單位和源自同一祖先的品種，說(shuō)明SSR標(biāo)記可以用于構(gòu)建白蠟的分子身份證。本試驗(yàn)所得的指紋圖譜的多態(tài)性高、特異性豐富，能夠達(dá)到鑒別生物個(gè)體之間差異的目的，具有高度的個(gè)體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，說(shuō)明通過(guò)指紋圖譜的差異性可以為品種的鑒定提供科學(xué)依據(jù)，這與SSR擴(kuò)增的目的片段多來(lái)自編碼基因之間的序列有關(guān)。本試驗(yàn)得出的結(jié)論在某種意義上可為供試品種在分子層面上的鑒定提供一定的依據(jù)，后期白蠟品種分子身份證鑒定的普遍適用性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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