板栗多糖研究進展

李紅燕 王應杏 李曉幸等

摘要板栗為藥食兩用的果中珍品，多糖是板栗的主要活性成分之一，在此綜述了國內(nèi)外有關(guān)板栗多糖的提取、分離純化、含量測定、化學結(jié)構(gòu)和生物活性等方面的研究進展，為推進板栗向功能產(chǎn)品和醫(yī)藥用品等多領(lǐng)域延伸、充分利用我國板栗資源優(yōu)勢提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞板栗；多糖；提取；分離純化；化學結(jié)構(gòu)；生物活性

中圖分類號S509.9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）31-082-03

Research Advances in Polysaccharides of Castanea mollissima Blume

LI Hongyan， WANG Yingxing， LI Xiaoxing et al

（Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis， College of Chemistry and Environment Science， Hebei University， Baoding， Hebei 071002）

AbstractCastanea mollissima Blume fruits can be used as medicine and food. Polysaccharide is one of the main active components of Castanea mollissima Blume fruits. In this paper， the recent progresses of polysaccharide from Castanea mollissima Blume were summarized on extraction， purification， content， structure and biological activities. This paper will benefit for the further study of Castanea mollissima Blume polysaccharides in functional products and medicinal supplies， and provide the theoretical basis for the full use of Chinese chestnut resources.

Key wordsCastanea mollissima Blume； Polysaccharide；Extraction； Separation and purification； Chemical structure； Biological activity

板栗為殼斗科（Fagacaea）栗屬（Castanea）植物Castaneamollissima Blume的果實，素有“干果之王”的美譽。板栗性溫，味甘，有益氣補脾、厚腸胃、補腎強筋、活血止血、清熱解毒、止瀉治咳等功效。臨床上，板栗還可用于治療反胃、泄瀉、腰腿軟弱、吐血、便血、金瘡等癥[1]。板栗對腎虛有良好的療效，故又名“腎之果”。我國板栗品種資源豐富，地域分布遼闊。我國板栗產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的3/4，為世界之最[2]。據(jù)文獻報道，板栗種仁中含有豐富的淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等，營養(yǎng)價值高[3]。近年來，國內(nèi)外學者已經(jīng)從板栗中分離得到具有多種生物活性的多糖類物質(zhì)，如抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗疲勞和升高白細胞等。筆者在此對近年來國內(nèi)外有關(guān)板栗多糖的提取、分離純化、含量測定、化學結(jié)構(gòu)和生物活性等方面的研究進展進行綜述。

1板栗多糖的提取方法

1.1水提取法

水提取法是傳統(tǒng)的提取多糖的方法，可分為冷水提和熱水提2種。冷水提取法主要得到的是存在于細胞壁外一些較易溶解的多糖類物質(zhì)，而熱水穿透能力強，可透過細胞壁將細胞內(nèi)的多糖提取出來。楊利劍[4]采用熱水法提取湖北羅田板栗多糖，其得率為13.2%。李潤豐等[5]研究發(fā)現(xiàn)熱水浸提法提取河北遷西板栗的最佳條件為溫度60 ℃、料液比1∶20、提取1.5 h的多糖得率為9.85%。戴成國[6]采用熱水浸提法提取陜西鎮(zhèn)安板栗中的多糖，通過正交試驗法得到最佳提取條件為料液比1∶30、溫度85 ℃、提取3 h、重復提取2次的得率為12.64%。水提取法提取時間較長，對多糖的化學結(jié)構(gòu)和生物活性有可能產(chǎn)生影響。目前，一般采用水提法和其他輔助方法相結(jié)合，以縮短提取時間且提高多糖的提取率。

1.2超聲波提取法

超聲波提取法是利用超聲波輻射產(chǎn)生的空化效應、熱效應和機械作用，形成高壓、高溫的環(huán)境，加速胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴散和溶解，提高提取率[7]。劉齊等[8]分別采用超聲波提取法、水提取法和堿提取法提取湖北羅田板栗殼中的多糖，發(fā)現(xiàn)超聲波提取率較高，為5.99%。李潤豐等[5]采用超聲波輔助提取法提取板栗多糖的得率為10.67%，高于熱水浸提法的得率（9.85%）。楊芳等[9]采用超聲波輔助提取板栗中多糖，得率為13.94%，提取時間對板栗多糖的提取得率影響最大。戴成國[6]通過超聲波輔助法提取陜西鎮(zhèn)安板栗中的多糖，當料液比為1∶25、超聲功率為150 W、在75 ℃提取3 h的得率為14.17%。

1.3亞臨界水提取法

亞臨界水提取法是在一定的壓力下，當水溫加熱到100～374 ℃時，水仍然保持液體狀態(tài)，但與常溫常壓水相比更類似于有機溶劑，水的極性在較大范圍內(nèi)變化，可實現(xiàn)天然產(chǎn)物中有效成分從水溶性成分到脂溶性成分的連續(xù)提取[10-11]。邵亭亭等[12]采用亞臨界水萃取板栗多糖，通過水料比、溫度、時間和壓力對提取條件進行了優(yōu)化，確定其最佳的提取條件為水料比20 ml/g、壓力5.0 MPa、溫度150 ℃、時間10 min，提取得率為14.89%。亞臨界水萃取法的提取得率和提取時間均優(yōu)于熱水浸提多糖。亞臨界提取法具有高效、省時等優(yōu)點。

1.4加壓溶劑萃取法

加壓溶劑萃取法是在較高的溫度（50～200 ℃）和壓力（6.8～20.4 MPa）下用有機溶劑萃取固體或半固體的自動化方法。梁雪等[13]采用加壓溶劑萃取法提取燕龍板栗中的多糖，通過對提取溫度、時間、壓力和循環(huán)次數(shù)的研究，發(fā)現(xiàn)最佳提取條件為提取溫度70 ℃、萃取壓力6 MPa、提取時間8 min、提取2次時板栗多糖的提取率最高，為20.14%。加壓溶劑萃取法溶劑用量少，萃取快速且效率高，對多糖結(jié)構(gòu)和生物活性的影響小。

此外，對板栗中多糖的提取方法還有堿提取法[7]、酸提取法[13]、微波提取法[13]等。

2板栗多糖的分離純化

多糖分離純化的方法有分級沉淀法、凝膠過濾法、親和層析法、活性炭脫色法、季銨鹽沉淀法、透析法、金屬絡(luò)合物法、離子交換層析法等。比較常用的方法為：提取后的粗多糖通過透析除去小分子的雜質(zhì)，Sevag法、蛋白酶法等脫蛋白，活性炭或大孔樹脂等脫色，離子交換柱色譜法按照多糖組分所帶的電荷分離和凝膠滲透柱色譜法按照多糖分子量的大小分離，從而得到均一的多糖組分。經(jīng)純化后的多糖組分采用比旋光度法、凝膠過濾法、高效凝膠滲透色譜法、電泳法、超離心法等對其純度進行鑒定，并參照分子量標準品對其相對分子量進行表征。邵亭亭[14]對羅田板栗粗多糖采用乙醇分步沉淀法，通過加入終濃度為40%、60%和80%的乙醇，按照多糖分子量的大小分級得到3種多糖組分CP1、CP2和CP3，采用Sephadex G100凝膠色譜柱對CP3組分進一步純化。李清宇等[15]從陜西鎮(zhèn)安板栗中提取得到粗多糖，經(jīng)DEAE52纖維素柱層析分離得到多糖組分CPS1和CPS2；CPS1和CPS2采用Sephadex G100柱層析進一步分離，收集單一對稱的洗脫峰，分別得到多糖組分CPSa和CPSb；以藍色葡聚糖和標準葡聚糖為分子量標準品，經(jīng)液相滲透色譜法檢測CPSa和CPSb的分子量分別為34.5和52.1 kDa。

3板栗多糖含量測定

可采用蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法等方法對多糖的含量進行測定。原理為多糖在濃硫酸作用下水解為單糖，再脫水形成糠醛衍生物，與蒽酮或苯酚形成有色化合物，通過紫外分光光度法測定其吸光度值來測定總糖含量。李潤豐等[16]采用蒽酮-硫酸法測得河北遷西板栗多糖的含量為12.67%。單舒筠等[17]采用蒽酮-硫酸法對河北遷西和遼寧丹東板栗多糖的含量進行測定，二者總多糖含量分別為5898%和35.83%。

4板栗多糖的化學結(jié)構(gòu)研究

多糖的分子量較大，化學結(jié)構(gòu)比較復雜。多糖的化學結(jié)構(gòu)主要包括單糖組成、分子量、糖苷鍵的類型、連接方式、連接順序、分支度、取代基等。多糖的結(jié)構(gòu)特征對其生物活性具有重要的影響[18-20]，明確多糖的化學結(jié)構(gòu)是進行其生物功能研究和開發(fā)應用的前期基礎(chǔ)。但多糖結(jié)構(gòu)的復雜性影響了對其活性及作用機理的研究。近年來，隨著波譜技術(shù)的發(fā)展，可采用核磁共振波譜、氣質(zhì)聯(lián)用色譜、質(zhì)譜等先進的儀器分析手段，并結(jié)合計算科學、生物化學、免疫學等，對多糖的結(jié)構(gòu)進行分析和改造，并對多糖的藥理作用和構(gòu)效關(guān)系等各個方面進行研究，推動多糖類藥物的發(fā)展。

李清宇等[15]從陜西鎮(zhèn)安板栗中分離純化得到多糖組分CPSa和CPSb，氣相色譜分析表明，CPSa主要由葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖組成，其摩爾比為7.1∶6.2∶5.1∶4.1；CPSb由葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖組成，摩爾比為7.1∶6.4∶6.2∶5.0∶4.1。楊利劍[4]通過氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)湖北羅田板栗多糖由葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖組成。陳和生等[21]通過紙色譜和氣相色譜分析表明羅田板栗多糖由葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖組成，比例為0.58∶1.00∶0.33∶0.18，平均分子量為164.0 kDa。邵亭亭[14]從羅田板栗中分離純化得到多糖組分CP3，薄層和氣相色譜法分析表明CP3主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖組成，其摩爾比為1.00∶0.71∶0.64∶4.94；剛果紅試驗發(fā)現(xiàn)CP3含有三股螺旋結(jié)構(gòu)。Yang等[22]發(fā)現(xiàn)板栗硬化后，細胞壁中1，3連接的果糖、1，3和1，6連接的葡萄糖含量減少，而1，4連接的阿拉伯糖、1，6連接的半乳糖和1，3連接的木糖含量均增加。Moine等[23]從西班牙栗的脫木素綜纖維素堿提取物中純化出葡萄糖醛酸木聚糖，結(jié)構(gòu)為線性β1，4連接的吡喃木糖，每6個木糖中有一個在C2位取代的4O甲基葡萄糖醛酸。Barbat等[24]從西班牙栗和刺阿干樹的脫木素蹤纖維素堿提取物中分離得到木聚糖，結(jié)構(gòu)為4O甲基葡萄糖醛酸木聚糖和木聚糖。目前，有關(guān)板栗多糖報道主要集中于多糖的提取方面，對其精細化學結(jié)構(gòu)方面的報道較少，這與多糖結(jié)構(gòu)本身的復雜性有很大的關(guān)系。

5板栗多糖的生物活性研究

多糖作為重要活性成分，日益引起國內(nèi)外研究學者的關(guān)注。目前，國內(nèi)外有關(guān)板栗多糖的文獻主要從以下幾個方面對其生物活性進行了研究。

5.1抗氧化活性

Wang等[25]對遼東丹東板栗葉中多糖的抗氧化活性進行研究，發(fā)現(xiàn)粗多糖CLP和純化后的多糖CLP1對羥基自由基、超氧陰離子和過氧化氫均具有中等強度的清除能力。邵亭亭[14]分析發(fā)現(xiàn)羅田板栗多糖具有抗氧化活性，分級沉淀后多糖對DPPH自由基的清除率增加，大小依次為CP3>CP2>CP1>CP；當CP3濃度為1 mg/ml時，對DPPH自由基的清除率為84.82%。李潤豐等[26]對板栗熱水提取多糖的抗氧化活性進行研究，發(fā)現(xiàn)板栗熱水提多糖對脂質(zhì)體氧化、Fenton反應產(chǎn)生的羥自由基和NO-2自由基均具有一定的消除或抑制作用，且活性與濃度呈正相關(guān)性。邵亭亭等[12]分析發(fā)現(xiàn)羅田板栗多糖在相同濃度下，亞臨界水萃取的抗氧化活性均高于常規(guī)熱水提取多糖。板栗沸水提多糖CPS對過氧化氫的清除效果與Vc相當，純化后多糖CSP1對羥自由基、超氧陰離子和過氧化氫的清除作用均降低[1]。戴成國[6]研究發(fā)現(xiàn)陜西鎮(zhèn)安板栗多糖在體外對還原力和DPPH自由基、超氧陰離子、羥基自由基的清除能力隨著多糖濃度的增大而增強。

5.2抗腫瘤活性

邵亭亭[14]研究發(fā)現(xiàn)羅田板栗多糖組分CP3濃度為1 mg/ml時，對人肝癌細胞HepG2和宮頸癌細胞HeLa的抑制率分別為32.79%和12.08%。梁雪[27]研究發(fā)現(xiàn)燕龍板栗多糖濃度為300 μg/ml時，對人肝癌細胞Bel7402、肺癌細胞A549和子宮癌細胞HCT8的生長抑制率分別為69.5%、51.4%和55.3%，且有劑量依賴關(guān)系。Barbat等[24]從西班牙栗中分離得到4O甲基葡萄糖醛酸木聚糖，其可抑制人表皮癌細胞A431的增生、遷移和侵襲的能力，此活性與其聚合度、4O甲基葡萄糖醛酸與木糖的比例以及4O甲基葡萄糖醛酸在木糖骨架上的分布密切相關(guān)。

5.3抗凝血、升高白細胞活性

羅田板栗多糖可明顯增強昆明種小鼠的凝血時間，升高小鼠的白細胞[4，21]。板栗多糖對機體損傷有保護作用。聶牧等[28]對板栗熱水提多糖的抗動脈血栓作用進行研究，發(fā)現(xiàn)板栗多糖（100、200 mg/kg）可明顯延長小鼠出血時間、凝血時間及血栓形成時間，降低血流波動性。板栗多糖抗動脈血栓作用機制與其抗血小板和抗凝血有關(guān)。

5.4抗疲勞作用

李清宇等[15]研究發(fā)現(xiàn)陜西鎮(zhèn)安板栗多糖中等劑量為200 mg/（kg·d）時，抗疲勞作用優(yōu)于低劑量100 mg/（kg·d）和高劑量400 mg/（kg·d）的效果，中等劑量的板栗多糖能顯著提高小鼠的運動耐力，降低運動后血乳酸和血尿素氮的含量，提高肌糖原和肝糖原的含量。

6展望

板栗作為藥食兩用的果中珍品，很早就被作為藥物治療各種疾病。研究表明，板栗中含有豐富的多糖類物質(zhì)，藥理試驗發(fā)現(xiàn)板栗多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、升高白細胞和抗疲勞等多種生物學活性。目前對板栗的開發(fā)應用尚處于初級階段。我國為板栗種植大國，產(chǎn)量為世界之最。目前我國主要以鮮板栗直接出口，產(chǎn)品附加值低。針對我國板栗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀，應加大科技創(chuàng)新投入，運用現(xiàn)代科技手段大力提升板栗的精深加工能力，如對板栗中活性多糖的結(jié)構(gòu)及其生物活性進行系統(tǒng)研究，研究開發(fā)高附加值的功能產(chǎn)品和醫(yī)藥用品等，為充分利用我國板栗資源優(yōu)勢拓展新的應用途徑。

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