復(fù)方金鈴四逆四物失笑散顆粒揮發(fā)油提取及羥丙基—β—環(huán)糊精包合工藝研究

白春霞等

摘要：目的 優(yōu)選復(fù)方金鈴四逆四物失笑散顆粒中揮發(fā)油提取工藝及羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）包合工藝。方法 采用L9（34）正交試驗(yàn)，以揮發(fā)油提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取工藝。以揮發(fā)油包合率和包合物收得率綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選最佳包合工藝。采用薄層層析法（TLC）對(duì)包合物進(jìn)行表征分析。結(jié)果 最佳提取工藝：藥材粉碎度為20目，加8倍量水，蒸餾提取8 h。最優(yōu)包合工藝：揮發(fā)油與HP-β-CD投料配比為1∶6，包合溫度30 ℃，研磨2 h。TLC圖譜顯示揮發(fā)油已被包合并形成穩(wěn)定包合物。結(jié)論 優(yōu)選的提取和包合工藝質(zhì)量穩(wěn)定、可行性強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：復(fù)方金鈴四逆四物失笑散顆粒；揮發(fā)油；羥丙基-β-環(huán)糊精；提取工藝；包合工藝；正交設(shè)計(jì)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.026

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）09-0095-04

Study on Extraction Process of Volatile Oil and Inclusion Preparation of Hydroxypropyl- β- cyclodextrin from Compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules BAI Chun-xia1， XIE Ping2， FENG Jian2， JIANG Chuan1， NING Hai-yan1 （1.Chengdu University of TCM， Chengdu 610072， China；2.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM， Chengdu 610072， China）

Abstract：Objective To optimize the extraction process of volatile oil and inclusion preparation of hydroxypropyl-β-cyclodextrin from compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules. Methods The orthogonal approach of L9 （34） was applied to investigate the volume of volatile oil extraction by 3 factors to obtain the optimum extraction conditions. With inclusion rate of volatile oil and yield of inclusion compound as comprehensive evaluation indexes， the optimum preparation conditions were discussed. The characterization of this prepared inclusion was analyzed by TLC. Results The optimum extraction conditions were as follows：the crude medicine with medicinal powder was shattered into 20 meshes；8 times the amount of water was added and was extracted for 8 h. The best inclusion conditions were as follows：the proportion of volatile oil to HP-β-CD was 1∶6， with inclusion temperature of 30 ℃， grinding time of 2 h. Analysis results of TLC showed that stable inclusion compound was formed from volatile oil and HP-β-CD. Conclusion The optimized extraction process and inclusion preparation are with stable quality and high feasibility.

Key words：compound Jinling Sini Siwu Shixiaosan Granules；volatile oil；HP-β-CD；extraction process；inclusion preparation；orthogonal approach

復(fù)方金鈴四逆四物失笑散顆粒（以下簡(jiǎn)稱“復(fù)方失笑散顆粒”）為成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院名老中醫(yī)針對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)實(shí)證病機(jī)“不通則痛”，在古方基礎(chǔ)上加減而得，處方主要由延胡索、柴胡、枳殼、當(dāng)歸、川芎、五靈脂等中藥組成，具有理氣活血、化瘀止痛之效。揮發(fā)油是方中當(dāng)歸、枳殼、柴胡及川芎主要活

通訊作者：馮儉，E-mail：fengjan222@tom.com

性成分，具有易揮發(fā)、氧化變質(zhì)及對(duì)光、熱穩(wěn)定性差等特性，在制劑過程中要避免揮發(fā)損失而保證藥效。

羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-β- cyclodextrin，HP-β-CD）為揮發(fā)油包合輔料，其外部親水性結(jié)構(gòu)及內(nèi)部親脂性內(nèi)腔能與脂溶性藥物形成水溶性包合物[1]，不僅溶解性高、對(duì)熱穩(wěn)定，且對(duì)腎、肌肉和黏膜幾乎無刺激，是一種低毒、安全、有效的水溶性包合輔料[2]。本試驗(yàn)結(jié)合HP-β-CD包合材料，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)和多指標(biāo)綜合評(píng)分法對(duì)藥材進(jìn)行提取工藝和包合工藝研究，從而控制制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

AS10300A型超聲清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器），F(xiàn)W135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），101A-I真空干燥箱（上海亞明熱處理設(shè)備有限公司），揮發(fā)油測(cè)定器（上海玻璃儀器廠），ZF-90多功能暗箱式紫外儀（上海寶山顧村電光儀器廠）。

川芎、當(dāng)歸、柴胡、枳殼均購(gòu)自成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院嚴(yán)鑄云教授鑒定，均符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。HP-β-CD（天津市博迪化工有限公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝研究

2.1.1 正交試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，按復(fù)方質(zhì)量配比（1∶1∶1∶1）稱取藥材共120 g，采用L9（34）法，以藥材粉碎度（A）、加水倍量（B）、蒸餾時(shí)間（C）為考察因素（見表1），以揮發(fā)油得量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄揮發(fā)油測(cè)定甲法[3]提取揮發(fā)油，優(yōu)選提取工藝，結(jié)果見表2、表3。

直觀分析可見，各因素對(duì)揮發(fā)油得率的影響次序?yàn)锳>C>B>D；方差分析顯示，因素A和C對(duì)揮發(fā)油得量有顯著影響（P<0.05），因素B對(duì)揮發(fā)油得量影響不大（P>0.05），為節(jié)約原料、降低成本，故選擇加水量為8倍量。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際確定揮發(fā)油提取工藝為A2B1C3，即藥材粉碎度20目、加8倍量水、提取8 h。

2.1.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱取復(fù)方比例混合藥材3份，按上述工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平均揮發(fā)油得量為1.46 mL，RSD=0.79%，表明此工藝條件重復(fù)性好。

2.2 揮發(fā)油提取

分別稱取4味藥材各600 g，按上述工藝參數(shù)提取揮發(fā)油，冷卻，用乙醚萃取3次，合并乙醚液，35 ℃下回收乙醚至小體積，加無水硫酸鈉脫水，過濾，揮干乙醚，密閉保存。

2.3 包合工藝優(yōu)化

2.3.1 制備方法考察 根據(jù)文獻(xiàn)[4-5]，分別采用研磨法、水溶液攪拌法、超聲波法對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行包合，以揮發(fā)油包合率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇最優(yōu)包合方法。

2.3.1.1 研磨法 稱取HP-β-CD 6 g，加蒸餾水30 mL，研磨成糊狀，緩慢滴加1 mL揮發(fā)油，溫水浴中研磨3 h，取出冷卻，冷藏24 h，抽濾，沉淀用石油醚洗滌，50 ℃真空干燥4 h，得粉狀包合物。

2.3.1.2 水溶液攪拌法 稱取HP-β-CD 6 g，加蒸餾水30 mL，置恒溫磁力攪拌器上，攪拌（200 r/min）成飽和水溶液，緩慢滴加1 mL揮發(fā)油，恒溫40 ℃攪拌3 h，取出冷卻，冷藏24 h，抽濾，沉淀用石油醚洗滌，50 ℃真空干燥4 h，得粉狀包合物。

2.3.1.3 超聲波法 稱取HP-β-CD 6 g，加蒸餾水30 mL，超聲混勻，緩慢滴加1 mL揮發(fā)油，恒溫40 ℃超聲處理3 h，取出冷卻，冷藏24 h，抽濾，沉淀用石油醚洗滌，50 ℃真空干燥4 h，得粉狀包合物。

2.3.2 包合物質(zhì)量評(píng)價(jià) 取等量上述3種包合物，分別置圓底燒瓶中，加100 mL蒸餾水，提取4 h以上，至油量不再增加時(shí)停止加熱，測(cè)定包合物中揮發(fā)油回收量。同時(shí)，精密移取1 mL揮發(fā)油，置圓底燒瓶中，同法操作，測(cè)得平均空白回收率（揮發(fā)油測(cè)得量÷?lián)]發(fā)油加入量×100%）為89%。計(jì)算揮發(fā)油包合率[包合物中實(shí)際揮發(fā)油量÷（揮發(fā)油加入量×空白回收率）×100%]，結(jié)果研磨法>水溶液攪拌法>超聲波法，見表4。采用最小顯著性差異法對(duì)3組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表5。方差分析結(jié)果顯示，3組樣本均數(shù)兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。綜合分析，選擇研磨法為揮發(fā)油最佳包合方法。

2.3.3 正交試驗(yàn) 采用研磨法，選擇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大的揮發(fā)油與HP-β-CD投料比（A）、包合溫度（B）及研磨時(shí)間（C）為考察因素（見表6）。以揮發(fā)油包合率和收得率[包合物質(zhì)量÷（HP-β-CD量+揮發(fā)油加入量）×100%]的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，二者權(quán)重系數(shù)分別為70和30，優(yōu)選最佳包合工藝，結(jié)果見表7、表8。

直觀分析顯示，各因素水平作用主次順序?yàn)锳>B>C，A2>A3>A1、B3>B2>B1、C3>C1>C2。方差分析結(jié)果表明，因素A對(duì)揮發(fā)油包合存在顯著影響（P<0.05），而因素B和C對(duì)包合結(jié)果影響不大（P>0.05）。考慮省時(shí)節(jié)能問題，包合溫度選擇30 ℃，研磨時(shí)間選取2 h。故各因素水平優(yōu)化組合為A2B1C1，即揮發(fā)油與HP-β-CD投料比為1∶6、包合溫度為30 ℃、研磨2 h。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱取適量揮發(fā)油和HP-β-CD各3份，按上述工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，包合物收得率、揮發(fā)油包合率平均值分別為86.26%、88.35%，RSD分別為1.28%、1.10%，表明此包合工藝穩(wěn)定、可行。

2.3.5 包合物穩(wěn)定性試驗(yàn) 取按上述最佳工藝制備的包合物7份置于燒杯中，另取揮發(fā)油1 mL置于有等體積水量的燒杯中，于50 ℃通風(fēng)恒溫箱放置7 d，并分別于1、2、3、4、5、6、7 d取樣，測(cè)定樣品溶液中揮發(fā)油得量，結(jié)果見圖1。可見，包合物中油釋放率明顯低于油水混合物中的釋放率，7 d后包合物含油量明顯高于油水混合物含油量，表明揮發(fā)油已被包合并形成穩(wěn)定包合物。

圖1 揮發(fā)油HP-β-CD包合物穩(wěn)定性分析

2.3.6 包合物薄層層析分析 取包合物3 g，加95%乙醇30 mL溶解，振搖后靜置1 h，過濾，取濾液，作為供試品溶液a；精密移取揮發(fā)油0.5 mL，加95%乙醇30 mL溶解，作為供試品溶液b；取包合物3 g，置100 mL圓底燒瓶中，加95%乙醇30 mL回流1 h，冷卻，過濾，取濾液，作為供試品溶液c；取空白HP-β-CD 3 g，同法制得供試品溶液d。吸取上述4種樣品，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（10∶1）為展開劑，展開，取出，揮干，噴以5%香草醛酸溶液顯色，置紫外光 燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示：b和c出現(xiàn)相同顏色熒光斑點(diǎn)，說明揮發(fā)油在包合前后成分未發(fā)生變化；a和d無相應(yīng)斑點(diǎn)出現(xiàn)，表明揮發(fā)油已被HP-β-CD包合并形成包合物。

3 討論

環(huán)糊精在藥物制劑方面應(yīng)用越來越廣泛，β-環(huán)糊精（β-CD）應(yīng)用最多，但因其本身水溶解度較低而限制了其在藥學(xué)鄰域中進(jìn)一步開發(fā)利用[6]。HP-β-CD較β-CD具有更好的水溶性和穩(wěn)定性，可提高油利用率和包合物得率，降低生產(chǎn)成本。同時(shí)，HP-β-CD克服了β-CD非胃腸道給藥的腎毒性缺點(diǎn)，為中藥新劑型開發(fā)提供了輔料基礎(chǔ)。

在提取工藝研究中，發(fā)現(xiàn)藥材粉碎度增大，顆粒間吸附力增大，提取率降低，且易發(fā)生糊化。藥材粉碎后宜立即提取，避免揮發(fā)油損失。本試驗(yàn)對(duì)包合物3種制備方法進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)研磨法所得包合物粉末性狀細(xì)膩、均勻，便于制劑混合均勻。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，包合能提高揮發(fā)油穩(wěn)定性并降低其釋放率，更有利于制劑。通過TLC對(duì)包合物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，揮發(fā)油已被包合在HP-β-CD空腔結(jié)構(gòu)內(nèi)，并形成了穩(wěn)定分子包合物相。此外，包合完成后，宜低溫放置，以減少包合物反溶解，提高包合物收得率。

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（收稿日期：2015-01-24）

（修回日期：2015-03-27；編輯：陳靜）