辣椒CaMAPK7啟動子順式作用元件及其表達分析

楊明星 申磊 文嘉瑜 唐倩 石蘭平 劉艷艷 楊晟 胡炯 劉彩玲 吳楊 何水林

摘 要 促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在植物生長、發育和適應環境中起著十分重要的作用，但對該家族多數成員的表達調控機制認識仍十分有限。前期實驗已分離獲得辣椒一個MAPK家族成員CaMAPK7，并發現該基因的表達受病原菌、高溫等逆境的誘導，但其表達調控機制仍不清楚。本研究進一步分離了CaMAPK7的啟動子序列（pCaMAPK7），發現其TATA框位于-165 bp與-170 bp之間，此外還發現W-box，HSE，TCA，LTR，ERE等多種與生物及非生物逆境脅迫應答相關的順式作用元件。通過構建該啟動子與報告基因GUS融合表達載體pCaMAPK7：：GUS，利用農桿菌介導的本氏煙草葉片瞬間表達系統分析發現pCaMAPK7可應答青枯菌接種及水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、油菜素內酯（BR）、脫落酸（ABA）和乙烯（ET）等外源激素處理，表明CaMAPK7應答青枯菌、外源激素處理主要是通過該啟動子介導的轉錄調節實現的。

關鍵詞 辣椒；啟動子；煙草瞬間表達系統

中圖分類號 S641 文獻標識碼 A

MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）聯結一般由MAPKKK、MAPKK 和MAPK組成，廣泛存在于真核生物中，參與介導細胞的生長、發育、分裂、分化及凋亡等多種生物學過程的調節，并與生長素、脫落酸、乙烯和細胞分裂素等信號通路有關，在植物生長、發育和適應生物脅迫及非生物脅迫的信號傳導中起重要的調節作用，但其表達調節和作用機制仍不清楚。

擬南芥[1]、小麥[2]、水稻[3]、辣椒[4]和短柄草[5]等大量的植物或作物基因組測序的完成和公布，為植物MAPK信號聯結成員的鑒定、表達調節和功能分析奠定了重要的基礎。已經在多種植物基因組中發現20個左右的MAPK成員，并對部分成員的表達和功能及其作用機制進行了分析。例如，研究表明棉花GhMPK2可以受到病原菌侵染的誘導表達并且其在煙草超表達可以明顯提高轉基因煙草對病原菌的抗性[6]，GhMPK17在棉花應答高鹽中起著重要的作用[7]，水稻MAPK家族成員IBR5在水稻耐干旱中起著負調控的作用[8]，這些結果表明MAPK通路在植物適應各類逆境脅迫過程中起著重要作用。本實驗室前期研究發現辣椒基因組中CaMAPK7在根、莖和葉中均有不同程度的組成型表達，其中以根部的表達最高，這種組成型表達可能與該基因參與植物的生長發育有關，另外，在葉片中則受到青枯菌侵染、高溫等逆境及水楊酸、茉莉酸甲酯和乙烯等外源激素處理的誘導，但脫落酸處理使其表達下調，暗示CaMAPK7可能在辣椒應答青枯病和高溫等逆境脅迫中起一定作用[9]，但其應答逆境或外源激素表達的分子機制還不太清楚。本研究利用GUS報告基因分析啟動子在生物與非生物逆境處理下的轉錄表達情況，不僅有利于闡明CaMAPK7應答幾種外源激素的分子機制，為進一步鑒定CaMAPK7功能奠定基礎，還可望為作物的遺傳改良提供有利用價值的誘導型啟動子或者順式作用元件。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒基因型CM334、本氏煙草、大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH10B、根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101、Gateway入門載體pDNOR-207及GUS融合載體pMDC163均由本實驗室提供。KOD高保真聚合酶購自北京百奧萊博科技有限公司，Gateway試劑盒購自Invitrogen公司，質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自泰京有限公司，各種抗生素購自上海生工生物有限公司，引物合成和測序均委托上海Invitrogen公司。其他常規試劑均為國產分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 CaMAPK7啟動子的克隆 利用CTAB法提取的辣椒CM334基因組DNA為模板，利用premier primer 5.0生物信息學軟件設計用于擴增該啟動子的上下游引物（F5′-GGGGACAAGTTTGTA

CAAAAAAGCAGGCTTCACCAATTTAAATAATGTAA

TAGAAA-3′R：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAA

GCTGGGTCTTCTCTGTTATTTTCAATATTCA-3′），采用KOD高保真酶進行PCR反應（程序：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；68 ℃，90 s，30 cycles，68 ℃，10 min），用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將擴增得到的PCR產物進行回收。

1.2.2 CaMAPK7啟動子轉化載體的構建 用Gateway法的BP反應將PCR產物連接到入門載體pDNOR-207，命名為pCaMAPK7-207，挑取經PCR驗證的陽性克隆送往英俊生物公司進行測序，測序確認無誤后使用Gateway的LR反應構建pCaMAPK7：：GUS目的表達載體，并命名為pCaMAPK7-163。PCR檢測為陽性的再使用凍融法轉化到農桿菌GV3101菌株中保存備用。

1.2.3 對CaMAPK7啟動子序列進行順式作用元件分析 把公司發回的測序結果與GenBank公布的辣椒（CM334）的啟動子序列在DNAMAN上進行比對，確定兩者之間的同源序列，比對結果無誤之后在PlantCARE網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）上對獲得的啟動子序列進行順式作用元件分析。

1.2.4 農桿菌介導的瞬間表達 將含有重組質粒的農桿菌在含75 μg/mL抗生素利福平、50 μg/mL卡那霉素和0.2 μg/mL LB固體（10 g Tryptone，5 g Yeast extract，10 g NaCl，15 g agar/L），培養基上劃線，28 ℃下培養2 d。挑取單克隆接種于2 mL含有相應抗生素的液體LB培養基中，28 ℃下以220 r/min震蕩培養過夜后，轉移至50 mL新鮮配制不加抗生素的LB液體培養基擴大培養，3 500 r/min離心15 min并收集菌液，用侵染液（10 mmol/L MgCl2，

10 mmol/L MES，200 mmol/L acetosyringone，pH5.1～5.4）重懸，終濃度為OD600=0.6～0.8。用不帶針頭的針管將菌液注射進事先用水拭擦干凈的生長健康且均勻一致的本氏煙草葉片中。將注射完滲透液的煙草移至25 ℃光照培養箱中（L ∶ D=16 h ∶ 8 h）。培養2 d后對煙草進行各種逆境處理。

1.2.5 煙草植株的幾種逆境處理 煙草植株的煙草青枯菌（R. solanacearum）接種：首先將-80 ℃保存的青枯菌FJC100301于4 ℃下溶化并在含有TTC的SPA固體培養基中劃線，28 ℃培養2～3 d，從SPA固體培養基中挑取單克隆接種于100 mL SPA液體培養基中，28 ℃搖床震蕩約24 h，搖至菌液OD600值達到1.0。菌液在3 500 r/min下離心10 min，去除上清，用10 mmol/L MgCl2重懸至終濃度為OD600=0.6，接著把調好OD600值的懸浮液用去掉針頭的注射器針筒注射先前已滲入含啟動子滲透液的各個煙草葉片中，同時以注射MgCl2的煙草葉片作為對照。處理后的煙草放回光照培養箱正常培養12 h和24 h后，分別采樣做GUS酶活性的測定。

煙草植株外源激素處理：對先前已注射啟動子滲透液的本氏煙草葉片分別進行外源激素處理。具體方法是將茉莉酸甲酯100 μmol/L、水楊酸1 mmol/L、脫落酸100 μmol/L、乙烯100 μmol/L和油菜素內酯10 μmol/L直接噴灑在已注射含啟動子滲透液的煙草葉片并保濕，置于25 ℃光照培養箱中（L ∶ D=16 h ∶ 8 h）處理12 h和24 h后分別采樣提取蛋白用于GUS定量分析，同時設置噴灑蒸餾水為對照。所有的處理均做6個重復。

1.2.6 CaMAPK7啟動子酶活性的測定 GUS酶活性的測定采用分光光度計法進行，具體步驟參考曾凡鎖[10]等的方法。酶活力單位為每分鐘水解PNPG生成1 nmol/L對硝基苯酚的酶量為一個單位。GUS活性以每mg蛋白的酶活力表示，實驗設置6次重復。

2 結果與分析

2.1 CaMAPK7基因的啟動子克隆及序列分析

通過PCR反應擴增出一條大小約為1 500的PCR產物，將該產物連接到入門載體pDNOR-207并測序，得到的測序序列與Genbank公布的辣椒CM334該啟動子序列比對，在順式作用元件分析網站plantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對獲得的序列進行分析，預測到多個與植物逆境相關元件，如高溫相關元件HSE、WRKY轉錄因子結合元件W-box、乙烯應答元件ERE、低溫應答元件LTR等（圖1）。

2.2 啟動子GUS融合載體的構建

通過特異性引物PCR的擴增，獲得了CaMAPK7啟動子PCR擴增片段（pCaMAPK7）（圖2），將該片段通過Gateway技術通過過渡載體pDONR-207進一步克隆到目的載體pMDC163中并驗證（圖3），最后將含pCaMAPK7：：GUS 的目的載體轉化到農桿菌GV3101并驗證（圖4），最終構建的融合表達載體（圖5）。

2.3 啟動子不同逆境和激素處理下的表達分析

在ABA、BR、ET、JA激素處理下，12 h和24 h時，GUS活性都出現了極顯著性差異（p<0.01），在12 h，分別為對照的3.53、2.12、3.55、3.37倍；在24 h，分別為對照的4.37、4.48、3.74、3.48倍；而在SA處理下，在12 h出現極顯著性差異，為對照的4.9倍，隨后在24 h又恢復到與對照沒有顯著差異；在接種青枯病處理后，在12 h出現極顯著性差異，為對照的2.63倍，24 h則有顯著性差異（p<0.05），為對照的2.56倍。在ABA、BR、ET、JA、SA和青枯菌接種處理下，pCaMAPK7驅動的GUS活性都出現不同程度的增強（圖6）。這些結果說明CaMAPK7啟動子能夠響應青枯菌和多種外源激素處理。

3 討論與結論

植物在其自然生境中總是不可避免地遭受到各種生物和非生物逆境脅迫，長期的進化也使植物形成了復雜的防御反應機制，包括對各種逆境的感知和信號傳遞，最終達到細胞核調節相關基因的表達以實現在生理生化水平上應對逆境的調節。植物的耐（抗）逆反應在很大程度上受到信號通路的調控，其中MAPKKK-MAPKK-MAPK級聯是植物應答逆境信號通路的重要組成成員，均由多基因家族編碼。大量研究表明，參與應答逆境的植物MAPK家族成員往往表現出對逆境脅迫的轉錄應答。本研究發現，辣椒CaMAPK7的啟動子區域中含有5個W-box、1個HSE、1個LTR和1個TCA等與生物以及非生物脅迫相關的順式作用元。其中W-box是可和特定WRKY轉錄因子相結合，而WRKY轉錄因子的不同成員可參與包括病害、高溫、干旱、高鹽等，還與SA、JA、ET等信號通路相關[11-16]。LTR元件是與低溫脅迫相關的元件[17-21]。ERE元件是一個與乙烯應答相關的元件[22]。HSE則可通過與HSF結合，介導目標基因對高溫脅迫的應答[23]。TCA在目標基因應答外源SA處理中起作用[24]。這些原件的存在與本實驗室前期研究發現該基因可受到青枯菌接種和高溫處理的誘導結合較為吻合。基于農桿菌注射的煙草外源基因瞬間表達分析方法已經在植物功能基因組學研究中得到了成功的應用[25]。本研究利用該方法分析了pCaMAPK7：：GUS中GUS報告基因對青枯菌接種以及外源激素處理的應答，結果發現pCaMAPK7驅動的GUS基因表達受到青枯菌接種和外源SA，JA，ET，BR 和ABA等激素處理的誘導，進一步表明CaMAPK7應答青枯菌接種和各種外源激素處理與其啟動子順式作用原件結合特地的轉錄因子在轉錄水平上調節所致。由于pCaMAPK7可協同應答SA，JA，ET，BR 和ABA等外源激素處理，暗示CaMAPK7可能參與了上述激素介導的信號通路，在辣椒耐高溫和抗病等反應中起重要的調節作用。未來進一步分離CaMAPK7的底物，將有助于進一步 解析CaMAPK7的作用辣椒的抗逆機制。

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