低溫脅迫對木薯組培苗葉片若干代謝生理指標的影響

歐文軍　羅秀芹　李開綿

摘 要 以木薯SC8和MS5供試材料，研究5 ℃低溫處理0、7、10、12和15 d對木薯組培苗葉片若干生理代謝指標的影響。結果表明：木薯種質SC8和MS5在5 ℃低溫脅迫下，隨著脅迫時間的延長，葉片的相對電導率、可溶性糖、丙二醛含量呈不斷上升趨勢，而可溶性蛋白、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性呈先上升后下降的變化趨勢；低溫脅迫下，葉片的相對電導率與丙二醛含量和可溶性糖含量呈極顯著正相關，與超氧化物歧化酶活性和可溶性蛋白含量呈極顯著負相關；可溶性蛋白含量與丙二醛含量呈顯著負相關，與游離脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性呈極顯著正相關；超氧化物歧化酶活性與可溶性糖含量呈極顯著負相關，與過氧化物酶活性呈極顯著正相關；主成分分析顯示超氧化物歧化酶活性、可溶性蛋白、可溶性糖和相對電導率在第1主成分中占有最大的信息量，與木薯耐寒性關系密切，可作為評價木薯耐寒性強弱的主要生理指標，其次是可溶性蛋白、丙二醛含量和過氧化物酶活性。綜合分析生理數據認為木薯MS5的耐寒性高于SC8，這為下一步從離體保存庫中直接采用組培苗方式進行大規模篩選耐寒種質提供參考方法。

關鍵詞 木薯；葉片；低溫脅迫；生理指標

中圖分類號 S537 文獻標識碼 A

木薯（Manihot esculenta Crantz）又名樹薯、木番薯，系大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot P. Miller）植物，其塊根富含淀粉，有“淀粉之王”之稱，其單位面積食物的能量超過水稻、小麥、高粱和玉米，是人類（特別是熱帶非洲國家）主要的食糧，迄今已有4 000 a的栽培歷史[1]。木薯起源于熱帶美洲，喜高溫，不耐霜凍[2]。一年中有8個月以上無霜期，年平均溫度18 ℃以上地方均可栽培[3]。木薯發芽出苗最低溫度為14～16 ℃，最適生長溫度為25～29 ℃，在14 ℃時生長緩慢，10 ℃以下停止生長，光合作用最低極限溫度為14 ℃，最高為40 ℃[4]。當溫度為0～4 ℃時，植株容易受到寒害；當溫度<0 ℃時，植株體內細胞活動幾乎停止，生長點被凍傷[5]。中國熱帶亞熱帶旱地資源達200萬hm2，可供開墾種植木薯的荒地達100萬hm2，隨著氣候變暖、抗寒品種選育和種莖越冬貯藏技術的逐步改善，中國木薯植區從目前北緯26°逐漸北移到27～30°，將現有木薯栽培面積約50萬hm2發展到100～150萬hm2[6]，但低溫傷害成為限制中國木薯北移的主要原因。2008年的低溫雨雪冰凍天氣給廣西木薯產業造成了前所未有的災害[7-8]。目前，大多數學者對木薯耐寒性的研究采用地栽苗或莖桿盆栽苗等方式進行[9-12]，鮮有用組培瓶苗的方式進行評價。因此，探討木薯組培苗葉片在低溫脅迫下的代謝生理特性，比較耐寒性的強弱，將為直接采用組培苗方式對離體保存庫的木薯資源進行大規模篩選耐寒種質提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為木薯SC8和MS5，來自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所木薯研究中心離體保存實驗室。

1.2 方法

1.2.1 前處理方法 選取培養40 d的組培苗置于恒溫恒濕箱內，在（25±1）℃、3 000 lx光照強度、16 h/8 h光照周期條件下將培養箱溫度設置為按0.03 ℃/min降低至5 ℃，其他條件不變，取低溫處理0、7、10、12和15 d的組培苗葉片（含葉柄），測定相應的生理生化指標。

1.2.2 生理指標測定 質膜相對透性測定采用相對電導率法（REC）；可溶性蛋白含量（wSP）、游離脯氨酸含量（wPro）測定按李合生[13]研究的方法，可溶性糖含量（wSS）測定按朱政[14]研究的方法，丙二醛含量（wMDA）測定按高俊風[15]研究的方法，超氧化物歧化酶活性（ASOD）測定按康俊梅[16]研究的方法，過氧化物酶活性（APOD）測定按孫文權[17]研究的方法，5項含量、2項活性指標均以樣品鮮重（Fresh Weight， FW）為基數。

1.3 數據分析

采用Excel2003對數據進行處理，利用SAS9.0軟件進行方差分析、新復極差測驗、相關性分析和SPSS19.0進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對木薯組培苗REC的影響

由圖1可知，低溫脅迫對2個樣本的膜透性表現出隨著脅迫時間延長而呈增加的趨勢；處理7 d內，2份樣本間REC差異不顯著，且均呈緩慢上升的趨勢；處理10 d開始，SC8的REC則極顯著的高于MS5；處理12 d后，REC均呈急劇上升，且2個樣本間的REC差距幅度進一步擴大；處理15 d時，SC8的膜透性是對照（0 d）的5.2倍；MS5的膜透性是對照（0 d）的3.0倍，可見低溫處理后木薯組培苗葉片的膜透性都遭到嚴重破壞，細胞內物質外滲比率明顯提高，隨著時間的延長，細胞膜受傷程度不斷加深，MS5與SC8之間的細胞膜穩定性存在明顯差異，且MS5表現出低溫脅迫對細胞膜更好的保護性。

2.2 低溫脅迫對木薯組培苗wSP的影響

由圖2可知，低溫脅迫對2個樣本的wSP呈先上升后下降的趨勢，在5 ℃處理12 d時，wSP曲線出現拐點，然后明顯由上升轉為下降；在低溫處理過程中，2個樣本的wSP都先由高于對照，在出現拐點后慢慢低于對照；且MS5的wSP在同一處理時間內均高于SC8；在處理12 d時，SC8和 MS5達到最大值，分別為42.73 mg/g和45.70 mg/g，是對照的1.07倍和1.12倍；處理10、12和15 d后，2個樣本的wSP均達到極顯著差異，說明wSP對低溫十分敏感；MS5增加wSP的能力顯著高于SC8，表現出對低溫脅迫更強的適應性。

2.3 低溫脅迫對木薯組培苗wSS的影響

由圖3可知，在5 ℃低溫脅迫15 d，2個樣本的wSS曲線整體表現為上升趨勢；在0～12 d，葉片的wSS變化不明顯，但呈緩慢上升趨勢；低溫處理12 d后，wSS均呈急劇上升趨勢；在低溫處理15 d時，MS5的wSS 是對照的1.63倍，SC8的wSS是對照的1.45倍，此時MS5的wSS顯著高于SC8。表明低溫誘導了木薯組培苗葉片細胞內可溶性糖含量的增加。在低溫條件下，不同木薯種質間可溶性糖累積的速度和量存在差異。

2.4 低溫脅迫對木薯組培苗wPro的影響

由圖4可知，低溫脅迫對2個樣本的wPro影響呈現出先升高后降低的變化規律；低溫脅迫7 d內，葉片的wPro幾乎無變化；在低溫脅迫7～10 d，葉片的wPro快速上升，低溫脅迫12 d時，2個樣本的wPro均達到峰值，達極顯著差異，其中MS5的wPro是對照的10.67倍，SC8的wPro是對照的3.40倍；低溫脅迫12 d后，2個樣本的wPro均呈急劇降低趨勢，但比對照高。表明低溫提高了木薯組培苗的wPro。在一定時間內，低溫脅迫促進了木薯細胞內wPro的升高；超過一定限度，低溫脅迫對脯氨酸的累積起負作用。

2.5 低溫脅迫對木薯組培苗wMDA的影響

由圖5可知，低溫脅迫對2個樣本的wMDA影響呈現逐步上升的變化趨勢；低溫脅迫7 d開始，SC8的wMDA急劇升高，到10 d后又轉而緩慢上升，處理15 d后含量達到38.17 nmol/g，是對照的1.61倍；而MS5幼苗葉片的wMDA在低溫脅迫7 d開始才緩慢上升，脅迫15 d后wMDA達到29.70 nmol/g，是對照的1.26倍；SC8的wMDA均高于MS5，且脅迫7 d開始，差異達極顯著，說明wMDA對低溫十分敏感。表明低溫處理前期（0～7 d）對木薯組培苗葉片內wMDA影響不大，隨著脅迫時間的延長，wMDA迅速提高，這可能是由于過度的脅迫導致膜脂嚴重過氧化。MS5的wMDA低于SC8，增加也較SC8緩慢，說明MS5減慢了膜脂過氧化作用，對細胞膜保護作用較強。

2.6 低溫脅迫對木薯組培苗ASOD的影響

由圖6可知，低溫脅迫對2個樣本ASOD的影響表現為先上升后下降的變化趨勢；處理7 d后，SC8的ASOD極顯著高于MS5；處理10 d后，MS5的ASOD極顯著高于SC8；處理12 d后，SC8的ASOD又反過來極顯著高于MS5；處理15 d后，2個樣品的ASOD差異不顯著。MS5在低溫脅迫10 d時其ASOD出現拐點，達到最大值58.62 U/（g·min），低溫脅迫15 d時降到21.47 U/（g·min）。SC8在低溫脅迫12 d時，ASOD出現拐點，達到最大值40.70 U/（g·min），脅迫15 d時降到21.37 U/（g·min）。低溫脅迫15 d時，MS5和SC8的ASOD低于對照，而處理10和12 d時，2個樣本的ASOD高于對照，表明ASOD對低溫十分敏感，低溫脅迫促使植物保持較高的ASOD來提高自身的防御力，而過長時間的脅迫，對整個SOD的防御系統造成嚴重損傷，導致酶活性迅速下降。

2.7 低溫脅迫對木薯組培苗APOD的影響

由圖7可知，低溫脅迫對2個樣本APOD的影響都出現先上升后下降的變化規律；處理7 d時，2個樣本的APOD上升均不明顯；處理10 d時，2個樣本的APOD均呈急劇上升，且MS5上升速率顯著高于SC8，此時2個樣本的APOD均達到峰值，分別為138.87和242.07 △OD/（g·min），此后2樣本的APOD又開始急速下降。處理10和12 d時，MS5的APOD均極顯著的高于SC8，但處理到15 d時，SC8的APOD極顯著的高于MS5，說明MS5的APOD對低溫更敏感。2樣本隨低溫脅迫時間不同，其POD活性均表現出差異極顯著，說明木薯的APOD對低溫十分敏感，一定時間內，低溫脅迫使植物APOD保持較高水平，但過長時間的脅迫將嚴重抑制APOD。低溫脅迫下，不同木薯種質的APOD響應速度不一樣，MS5的APOD對低溫更敏感。

2.8 木薯葉片生理生化指標的相關性分析

由表1可知，wSP與REC、wMDA和wSS呈負相關，且與REC呈極顯著負相關，與wMDA呈顯著負相關，與wPro、ASOD和APOD呈極顯著正相關。ASOD與wSS呈極顯著負相關，與APOD呈極顯著正相關。REC與wMDA和wSS呈極顯著正相關，與ASOD和wSP呈極顯著負相關。說明植物在低溫脅迫下，可以通過降低細胞內wMDA和wSS或提高ASOD和wSP來減少低溫對細胞膜透性的傷害，從而提高植物的耐寒性。

2.9 低溫脅迫對木薯葉片生理生化指標的主成分分析

由表2可知，前3個主成分的累積貢獻率達到86.97%，基本綜合反映了2個木薯種質耐寒性的絕大多數信息。因此，選取前3個主成分為主成分分析的依據并進行綜合評價。第1主成分的特征值為3.305，貢獻率為47.22%，因子負荷系數絕對值較大的依次為ASOD、wSP、wSS和REC（表3），因此第1主成分由ASOD、wSP、wSS和REC指標決定。第2主成分的特征值為1.619，貢獻率為23.12%，以wPro和wMDA的負荷系數絕對值較大，因此第2主成分由wPro和wMDA決定。第3主成分的特征值為1.164，貢獻率為16.63%，其中以APOD的負荷系數絕對值最大，第3主成分由APOD決定。主成分分析結果（表3）顯示：木薯組培苗隨著低溫脅迫的加劇，細胞膜最先受到脅迫，膜脂過氧化作用加強，膜逐步被破壞，膜透性在不斷增大，丙二醛在細胞內大量累積，植物通過提高抗氧化酶SOD、POD活性和細胞內滲透調節物質可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸的含量來降低低溫所造成的傷害，保護細胞膜透性從而提高植物的耐寒性。其中，ASOD、wSP、wSS、和REC在第1個主成分中占有最大的信息量，與木薯耐寒性關系密切，可作為評價木薯耐寒性的主要測試指標。