橡膠草根部離體培養誘導植株的研究

賈瑞 吳坤鑫 王穎 賈賢 陳雄庭

摘 要 以橡膠草的根部作為外植體進行組織培養和快速繁殖研究。結果表明：橡膠草根部外植體防止褐化的最佳方法為MS+500 mg/L AC預培養3 d；根部愈傷組織誘導的最佳培養基為MS+0.6 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L 2，4-D，平均誘導率為90%；分化培養基為MS+0.8 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA；生根培養基為1/2MS+0.2 mg/L NAA。

關鍵詞 橡膠草；愈傷組織；再生體系

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A

橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）， 是菊科（Compositae）蒲公英屬（Taraxacum）的多年生草本植物。橡膠草具有較強的生長繁殖能力，能夠生長在較寒冷的地區，產生優良種子，極容易種植，并且具有較強抗菌能力和抗蟲害能力。橡膠草外形與蒲公英非常相似，但根部可以分泌與巴西橡膠樹成分相當的優良天然橡膠，其干重約占根部成分的20%[1-2]，在工業上有重要的利用價值，可為緩解我國橡膠產業不足，依賴進口的現狀提供支持。橡膠草的生長較巴西橡膠樹而言，適宜栽培的地區廣，適應性強，生長速度快，在我國華東、華北、東北和西北等地區均適宜進行橡膠草的種植，是極具經濟發展前途的產膠植物[3]。

目前國外學者對橡膠草的研究從形態結構、組織生理、栽培技術等方面轉向對橡膠草的產膠蛋白顆粒及相關的酶進行分子生物學研究[4-6]，而國內學者也開始從形態學方面研究逐漸向分子遺傳轉化方向發展，并已通過葉片作為外植體，初步開展了橡膠草再生體系的研究[7-9]。但由于目前再生體系并不夠成熟，發展進度較為緩慢。本文以橡膠草根部為材料進行愈傷組織的誘導、分化以及生根的研究，為橡膠草組培快繁和遺傳轉化體系的建立奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所橡膠樹細胞工程研究室種子繁殖的試管苗為供試材料。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制 以MS為基本培養基，添加3 g/L蔗糖和5 g/L瓊脂粉，根據試驗設計，在不同培養階段附加不同濃度的植物生長調節劑，pH調至（5.8±0.1），121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min，分裝于組培瓶或培養皿中備用。

1.2.2 材料的處理 將保存于培養箱內的橡膠草試管苗進行生根培養，待根長達5 cm以上時，將根切成長約1.5～2 cm的小段備用。

1.2.3 外植體的的預培養 在MS基本培養基中分別加入活性炭300、500、700 mg/L，并以不添加活性炭MS作為對照。每個處理接種到5個培養皿，每個培養皿接種5個外植體，3次重復，（23±2）℃進行暗培養，3、7、10 d后分別對其進行觀察統計。褐化率（%）=外植體褐化數/接種外植體數，死亡率（%）=外植體死亡數/接種外植體數。

1.2.4 愈傷組織的誘導 以MS為基本培養基，根據試驗要求附加不同濃度的2，4-D和6-BA，每個處理接種5個培養皿，每個皿接種5個外植體，3次重復。在光照周期為14 h/d，溫度為（23±2）℃，光照強度為1 800～2 000 lx的條件下培養，7 d后對其進行觀察統計。愈傷組織的誘導率（%）=產生愈傷組織的外植體數/接種外植體數。

1.2.5 誘導愈傷組織分化 將綠色、顆粒狀、質地堅硬的愈傷組織接種于附加不同濃度NAA和6-BA的MS培養基上，每個處理接種5個培養瓶，每瓶接種3個外植體，3次重復。在光照周期為14 h/d，溫度為（25±2）℃，光照強度為1 800～2 000 lx的條件下培養，7 d后對其進行觀察，14 d后對其進行統計。誘導率（%）=產生分化的愈傷組織數目/接種愈傷組織的數目。

1.2.6 生根培養 待苗長到3 cm左右的時候轉入的生根培養基中誘導根的產生。在光照周期為14 h/d，溫度為（25±2）℃，光照強度為1 800～2 000 lx的條件下培養，14 d后對其進行觀察統計。生根率（%）=生根苗數/總的接種苗數。

1.2.7 煉苗與移栽 將株高5 cm以上，根長5 cm左右的橡膠草組培苗進行煉苗移栽，移栽前先將組培苗的瓶蓋打開一半放置于陰涼的地方3 d后，將幼苗基部的瓊脂洗凈，用0.1%的多菌靈浸泡30 min，然后將其移栽到小盆中，移栽基質為營養土 ∶ 砂石 ∶ 蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1的混合基質。移栽后先將苗放置于光照強度為1 800～2 000 lx的培養箱預煉苗7 d，然后再將其完全暴露于自然的環境下。

1.3 數據分析

該試驗數據采用SAS 9.0數據處理系統進行數據分析。試驗中所獲得的各處理數據均先進行方差分析，在p﹤0.05水平上，采用LSD法做多重比較[10-11]。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度活性炭和處理時間對外植體褐化率和死亡率的影響

由表1可知，在未添加活性炭的培養基中，接種3 d，外植體切口開始出現褐化（圖1-A），接種7 d后整個外植體褐化，隨后死亡（圖1-B），在培養基中添加500 mg/L的活性炭，外植體接種7 d后，只有少數出現褐化現象，抑制褐化的效果好，且對外植體的傷害最小（圖1-C）。但當活性炭濃度增加到700 mg/L，接種7 d后，褐化雖然得到一定程度的抑制，但外植體開始變黃，隨后慢慢死亡（圖1-D），說明活性炭的吸附作用沒有選擇性，在吸附有毒物質的同時也吸收培養基里的營養元素，從而導致外植體的死亡。在相同活性炭濃度的不同組合中，褐化率和死亡率總體上隨著時間的增加而增加。從褐化率的多重比較結果可知，處理7、8、9、10之間差異不顯著，且極顯著的低于其他處理組，其中處理7、10均值最低，且都為0.00%，但處理10逐漸出現死亡現象，從節約成本和時間的因素考慮，選擇處理7作為抑制外植體褐化現象的最佳處理。從死亡率的多重比較結果可知處理7、8、9、10之間無顯著差異，且極顯著的低于其他處理組，其中處理7、8、10均值最低都為0.00%，但處理10逐漸出現死亡現象，綜合考慮，選擇處理7作為抑制外植體褐化現象的最佳處理。故根部作為外植體時，選擇處理7作為抑制外植體褐化現象和死亡現象的最佳處理，即MS+500 mg/L AC預處理3 d。

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