蓮子低聚糖提取工藝優化及其組分分析

盧旭 張帥 林姍 吳小婷 張怡 鄭寶東

摘 要 采用響應面分析法對蓮子低聚糖熱水浸提工藝參數進行優化，探討浸提時間（min）、浸提溫度（℃）和水料比（V/W）對熱水浸提蓮子低聚糖得率的影響，建立提取蓮子低聚糖的二次項數學模型并驗證其可靠性，得到最優提取工藝參數，并采用高效液相色譜法對蓮子低聚糖組分進行初步分析。結果表明：熱水浸提蓮子低聚糖的最佳提取工藝條件是浸提時間為66 min，浸提溫度為81 ℃，水料比為80 ∶ 1，在此工藝條件下蓮子低聚糖得率為8.09%。影響低聚糖提取工藝的主次因素順序為：水料比>浸提溫度>浸提時間。高效液相色譜法測定蓮子低聚糖，發現蓮子低聚糖由四聚糖、三聚糖和二聚糖組成。

關鍵詞 蓮子；低聚糖；提取工藝；響應面法；高效液相色譜

中圖分類號 R282.71 文獻標識碼 A

蓮子是中國重要的出口創匯特色農副產品之一，除福建、江西兩省為主要產區外，在浙江、湖南、江蘇、湖北、河北、臺灣等省亦均有商業栽培。蓮子為藥食兩用食品，除含有豐富的淀粉、蛋白質、生物堿和類黃酮外，還含有超氧化物歧化酶、低聚糖、多糖等功效成分[1-2]。目前，低聚糖已被證實為有效的雙歧桿菌增殖因子之一[3-5]，攝入低聚糖可調節腸道菌群，從而起到增強機體免疫、降血脂、降血壓等功能[6]。低聚糖的聚合度對益生菌利用率具有重要的影響，其吸收能力一般隨分子量的減小而增大，同時對抗致病菌能力也有一定的影響，聚合度越低的低聚糖抗菌活性越強[7-9]。吳小南等[10]將發酵蓮子乳灌胃小鼠，結果發現灌胃后的小鼠結腸運動加快，腸內糞便滯留時間減少，推測可能與發酵蓮子乳中含有大量的棉子糖類似物有關。

低聚糖獲取方式主要包括化學合成法和以動植物為原料來源的溶劑提取法[11]、酶解法[12]、生物法[13-14]等。響應面設計法（Response Surface Method，RSM）能夠克服傳統數理統計方法處理數據量大、不能分析因素之間交互影響和精度不高的缺點，隨著計算機應用技術的發展，此法已廣泛應用于食品工業中的加工提取工藝及工藝配方設計的優化[15]。

本研究以速凍鮮蓮為供試原料，研究浸提時間、浸提溫度和水料比等單因素對熱水浸提低聚糖得率的影響。采用苯酚-硫酸法測定低聚糖含量，使用中心組合設計響應面分析法優化蓮子低聚糖熱水浸提工藝參數。同時通過高效液相色譜法對蓮子低聚糖的小分子糖類成分及各組分聚合度進行測定，為充分開發利用蓮子低聚糖資源及工業化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 速凍鮮蓮：由綠田（福建）食品有限公司提供；95%乙醇，購自國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖和棉籽糖：購自美國sigma公司；水蘇糖：購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.1.2 儀器設備 FW177中草藥粉碎機：購自天津泰斯特儀器有限公司；DHG-9053A電熱鼓風干燥箱：購自上海一恒科學儀器有限公司；SH-Ⅱ循環水式多用真空泵：購自鄭州長城科工貿有限公司；RE-5298A旋轉蒸發儀：購自上海亞榮生化儀器廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋：購自國華電器有限公司；FD-4C-80冷凍干燥機：購自北京博醫康實驗儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：購自日本島津。

1.2 方法

1.2.1 蓮子低聚糖提取工藝流程 速凍鮮蓮取出后解凍1 h，篩選去芯后放入鼓風干燥箱50 ℃烘干至恒重。干燥后的蓮子粉碎過100目篩，按一定水料比加入去離子水，以一定溫度加冷凝管回流提取一定時間后過濾，棄濾渣。濾液經真空濃縮后加入3倍體積95%乙醇，于4 ℃靜置隔夜，離心得上清液。

1.2.2 單因素實驗 分別考察浸提時間、浸提溫度及水料比對蓮子低聚糖得率的影響，以苯酚-硫酸法[16]計算蓮子低聚糖得率。苯酚-硫酸法以葡萄糖作為標定物換算低聚糖的濃度，標準曲線為Y=0.007 2 X-0.003 3（R2=0.998 4），式中：Y為溶液在490 nm波長處的吸光度值；X為溶液中葡萄糖濃度（μg/mL）。

蓮子低聚糖得率=×100% （1）

式中：C為測定溶液中蓮子低聚糖濃度（mg/mL），V為測定溶液體積（mL），n為溶液稀釋倍數，m為蓮子干重質量（mg）。

1.2.3 響應面優化試驗 參考單因素試驗結果和試驗誤差控制，選擇浸提時間、浸提溫度及水料比3個因素進行3因素3水平優化試驗。采用中心組合設計（Central Composite Design），利用響應面法對提取條件進行優化。以蓮子低聚糖得率（Y/%）為考察指標，以浸提時間（A）、浸提溫度（B）及水料比（C）為自變量，因素水平編碼見表1。

1.2.4 驗證試驗 根據所建立的二次項數學模型預測蓮子低聚糖在最佳提取工藝參數下的得率，相同條件下測定蓮子低聚糖的實際得率，以驗證響應面預測的準確性。

1.2.5 蓮子低聚糖組分分析 采用高效液相色譜法對蓮子低聚糖組分進行初步分析。取1.2.1步驟所產生的蓮子低聚糖粉末，加去離子水定容至100 mL，取待測溶液1 mL經0.22 μm微孔膜過濾后注入高效液相色譜分析。

色譜條件為上樣量：20 μL；色譜柱：安捷倫Hi-plex Na（Octo）柱（300 mm×7.7 mm，8 μm）；流動相：蒸餾水；檢測器：RID-10A示差檢測器；流速：0.6 mL/min；柱溫：85 ℃。

1.3 數據分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面優化設計。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 浸提時間對蓮子低聚糖得率的影響 由圖1可知，當浸提溫度為70 ℃，水料比為40 ∶ 1時，蓮子低聚糖的得率隨著浸提時間的延長出現先增后降的趨勢。當浸提時間為60 min時，蓮子低聚糖的得率達到峰值。浸提時間太長可能導致部分蓮子糖類物質與游離氨基酸發生美拉德反應，使得溶液色澤加深，低聚糖得率降低[17]。由此確定最佳浸提時間為60 min。

3 討論與結論

多數植物的根莖、果實和種子均含有豐富的低聚糖，目前提取天然植物低聚糖的對象主要有大豆、火龍果、麥麩、大蒜、藻類、地黃等植物。本實驗通過響應面法優化熱水浸提蓮子低聚糖工藝并對各影響因素間的相互作用進行研究，得到蓮子低聚糖得率影響因素的主次順序依次為：水料比>浸提溫度>浸提時間，各因素之間無交互作用。蓮子低聚糖提取最佳工藝條件：浸提時間為66 min，浸提溫度為81 ℃，水料比為80 ∶ 1；實際測得低聚糖得率為8.09%，與理論預測值8.08%基本一致，與山藥（7.21%）[22]、雪蓮果（6.32%）[23]和肉蓯蓉（3.72%）[24]等原料相比提取得率較高，說明蓮子中低聚糖含量較高。已有研究結果表明，不同的提取方法對低聚糖得率有顯著影響，唐雪娟[25]以超聲波法輔助提取香蕉低聚糖，得率（17.89%）明顯高于溫水法提取香蕉低聚糖的得率。宋春麗等[26]的研究結果表明，以高溫變性豆粕為原料提取大豆低聚糖，微波輔助提取微波輔法提取低聚糖的效果優于超聲波法。田玉庭等[27]采用超聲波法輔助提取蓮子低聚糖，蓮子低聚糖得率為1.13%。本研究經熱水浸提的蓮子低聚糖得率高于超聲波輔助提取法，可能與前者提取過程中所采用的脫蛋白、酵母發酵等中間步驟過多有關，造成低聚糖在提取過程中大量損失，導致最終得率降低。

上述低聚糖提取研究中，并未對低聚糖組成成分做出具體說明。本研究高效液相色譜結果表明，蓮子低聚糖含有3個組分，主要由二聚糖、三聚糖和四聚糖構成，以三聚糖和四聚糖為主，這與花生粕低聚糖和大豆低聚糖的組成成分相似[28-29]，提示蓮子低聚糖可能具有良好的機體吸收利用能力，且可能具有與大豆低聚糖相似的生理活性功能。蓮子低聚糖在高效液相色譜的保留時間與水蘇糖、棉籽糖、蔗糖相近，為較低分子量的低聚糖；據孫麗萍等[30]報道不同分子量低聚糖的體外清除自由基的活性有差異，分子量小于1 000的褐藻膠寡糖比分子量更大的褐藻膠寡糖具有較優的清除自由基能力，推測蓮子低聚糖相比聚合度較大的低聚糖，可能具有良好的生理活性。由于相同分子量的低聚糖可能還含有不同糖苷鍵異構體，較難通過色譜柱將其完全分離，因此蓮子低聚糖各成分的具體結構和生理活性還有待于進一步深入研究。

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