硫酸銨在蛋白質含量測定中的參比作用初探

王亞棋 黎雋 劉立科等

【摘要】目的 中國藥典2010版附錄Ⅶ D 氮測定法第二法，是蛋白質含量測定的經典方法。但參考蛋白難于獲得，檢測結果缺乏參比性。本文嘗試以分析純硫酸銨為參考品，檢測關節軟骨再生支架樣品中的蛋白質含量。方法 分別稱取三份硫酸銨，與蛋白樣品一起，在相同條件下測試其回收率，用以參照評價蛋白樣品的檢測結果。結果 硫酸銨的回收率接近100%，不考慮消化樣品的差異，可以確認樣品測定結果。 結論 在沒有標準蛋白作參比的情況下，在凱氏定氮法中引入硫酸銨，可以很好的監測實驗結果。

【關鍵詞】蛋白質；測定；硫酸銨

【中圖分類號】R151.2 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）03-0011-01

蛋白質是由氨基酸以酰胺鍵（ 肽鍵） 相結合形成的結構極其復雜的高分子化合物， 是生物體中的主要含氮物質。蛋白質與細胞結構、酶、激素、病毒、免疫、物質轉運和遺傳等密切相關， 蛋白質的定量測定是生物化學和其他生物科學、食品檢驗、臨床檢驗、疾病診斷和質量檢驗中最重要的工作。蛋白質測定方法一般可分為間接方法和直接方法。間接方法是通過測定樣品中蛋白質的含氮量進行推算蛋白質含量的方法。直接方法則是根據蛋白質的物理和化學性質， 直接測定蛋白質含量的方法。多年來， 利用蛋白質的主要性質（ 如含氮量、肽鍵、折射率等） 和利用蛋白質含有的特定氨基酸殘基（ 如芳香基、酸性基、堿性基等） ， 測定蛋白質的方法不斷發展， 主要有凱氏定氮法（ 國際經典測定方法） 、分光光度法、電化學法、滴定法、高壓液相色譜法、電泳法、免疫法等[1]。蛋白質是食品中的重要營養成分，也是評價食品營養價值的重要指標之一[2]，隨著科學技術的向前發展，蛋白質被引入到很多醫療器械中，并成為評價該醫療器械質量的重要指標。在運用凱氏定氮法測定其蛋白質含量時，常常沒有合適的標準參考蛋白，而且在不同參考蛋白模式下得到的評價差距較大，在作為蛋白質生物價的估計時不夠理想和滿意[3]。為此。我們選用硫酸銨作對照，起到了一定的參比作用。

凱氏定氮法測定蛋白質分為樣品消化、蒸餾和吸收、滴定等過程。在催化劑作用下， 試樣用濃硫酸消煮破壞有機物， 使其中的蛋白質氮及其他有機氮轉化為氨態氮， 然后與硫酸結合生成硫酸銨。加入強堿進行蒸餾使氨逸出， 用硼酸吸收后， 再用酸滴定， 測出含氮量， 將結果乘以換算系數， 計算出粗蛋白質含量[4-6] 。它是測定試樣中總有機氮最準確和最簡單的方法之一，被國際國內作為法定的標準檢驗方法。通常認為該法關鍵環節有濃硫酸用量、催化劑選擇、消化時間、氫氧化鈉用量和硼酸吸收液指示劑選擇等[1]。但在我們的實踐中發現，在用標準硫酸溶液進行滴定時，特別是在使用全自動點位滴定儀時，終點的選取也很關鍵。這時選用合適的參照品就很重要了。為此，我們就用硫酸銨解決了這一問題。

材料和方法

1.實驗器材：

半微量法凱氏定氮儀、50ml凱氏燒瓶、移液管、滴定管、錐形瓶、試管、電子萬用爐、容量瓶、電子天平

2.試劑：

關節軟骨再生支架、分析純硫酸銨、稀硫酸、甲基紅指示液、30%硫酸銅溶液、2%硼酸溶液、甲基紅-溴甲酚綠混合指示液、40%氫氧化鈉溶液、0.05mol/L硫酸滴定液、0.005mol/L硫酸滴定液、硫酸鉀、硫酸

3.試驗步驟：

按照《中華人民共和國藥典2010年版二部》附錄Ⅶ D 氮測定法第二法所示，連接蒸餾裝置，在1000mL圓底燒瓶A中加水適量（約500mL）和甲基紅指示液8滴，再加稀硫酸使成酸性，加沸石5粒，從漏斗D中加水約50mL，關閉漏斗與連有氮氣球的蒸餾器之間的橡皮管夾。開放冷凝水，煮沸1000mL圓底燒瓶A中的水，當蒸汽從冷凝管尖端冷凝而出時，移去火源，關閉1000mL圓底燒瓶A與安全瓶連接的橡皮管夾，使連有氮氣球的蒸餾器中的水反抽到安全瓶，放開與漏斗連接的橡皮管夾，放出安全瓶中的水，關閉安全瓶與漏斗連接的橡皮管夾，將冷凝管尖端插入約50mL水中，使水自冷凝管尖端反抽至連有氮氣球的蒸餾器瓶C，再抽至安全瓶B中，如上法放去。如此將儀器內部洗滌3次。

按實驗設計，分別取供試品和對照品適量（約相當于含氮量1.0～2.0mg），精密稱定，置干燥的50mL凱氏燒瓶中。加硫酸鉀0.3g與30%硫酸銅溶液5滴，再沿甁壁滴加硫酸2.0mL；在凱氏燒瓶口放一小漏斗，并使凱氏燒瓶成45°斜置，用小火緩緩加熱使溶液保持在沸點以下，等泡沸停止，逐步加大火力，沸騰至溶液成澄明的綠色后，繼續加熱10分鐘，放冷，加水2mL。

取2%硼酸溶液10mL，置100mL錐形瓶中，加甲基紅-溴甲酚綠混合指示液5滴，將冷凝管尖端插入液面下。然后，將凱氏燒瓶中內容物經由漏斗轉入連有氮氣球的蒸餾器C中，用水少量淋洗凱氏燒瓶及漏斗三次，再加入40%氫氧化鈉溶液10mL，用少量水再洗漏斗三次。關閉漏斗與連有氮氣球的蒸餾器之間的橡皮管夾，加熱1000mL的圓底燒瓶A進行蒸氣蒸餾，至硼酸液開始由酒紅色變為藍綠色時起，繼續蒸餾約10分鐘后，將冷凝管尖端提出液面，使蒸氣繼續沖洗約1分鐘，用水淋洗尖端后停止蒸餾。

結 果

取餾出液用0.005mol/L的硫酸標準溶液滴定至溶液由藍綠色變為灰紫色，并將滴定的結果用空白試驗校正。下表為檢測結果。不論是樣品還是對照品硫酸銨，都得出了平行性較好的結果。具有一定的可信度。

計算公式：

6.25---氮換算蛋白質的系數；

討 論

針對實驗室在檢測檢驗過程中缺乏蛋白質權威計量方法、標準物質及校準規范造成蛋白質相關醫療器械無法檢定校準的問題，著重進行蛋白質含量和分子量權威計量方法研究、檢定校準用蛋白質標準物質研制以及蛋白質相關醫療器械校準規范起草工作，非常必要。在此之前，利用凱氏定氮法的相關原理，引入硫酸銨等作為對照，可以增加檢測檢驗結果的信心。

樣品在消化時加入濃硫酸的量必須過量。 一是脫水作用， 將樣品中有機物脫水然后碳化成C；二是氧化作用， 濃硫酸和硫酸鉀、硫酸銅一同加熱使溫度達到400攝氏度以上， 碳還原硫酸生成SO2，而碳本身被氧化成CO2；三是分解作用， 將蛋白質分解， SO2 還原N生成銨根離子NH+4 ， 本身被氧化成SO3；四是吸收作用， 生成的銨根離子NH+4與濃硫酸反應生成硫酸銨（NH4）2SO4；五是生成的（NH4）2SO4保存在濃硫酸溶液中不至于損失[ 5， 7] 。樣品消化過程要加入催化劑， 加入硫酸鉀能夠提高分解時溶液的溫度， 使溶液沸點由290 攝氏度提高到400攝氏度。加入硫酸銅、氧化汞和硒粉則能促進試樣的分解， 縮短消化時間。有試驗證明， 用硒粉作催化劑可加快消化速率， 縮短試樣消化時間， 其測定結果與硫酸銅作為催化劑的傳統方法相當吻合[8] ， 但硒粉使用量過多或與硫酸作用時間過久會使銨態氮成為分子氮而損失[9] 。雖然加入氧化汞能夠節省消化時間， 但由于污染較重， 多用于仲裁檢驗[8]。目前包括國標方法大多加入硫酸鉀和硫酸銅混合催化劑，但眾多文獻中二者用量的比例有所不同， 硫酸鉀B硫酸銅比例主要有15：1、10：1、10：0.9 和9：1等[ 2- 3， 8- 9] ， 國標方法采用10：1比例， 硫酸銅用量是影響消化時間的主要因素[10] 。樣品消化過程中， 消化液經過一系列改變最終轉變為綠色透明狀態， 這種過程是碳化的有機物完全被氧化的變化， 但決不表示樣品中的氮素全部轉變為NH+4 。蒸餾過程中加入40%氫氧化鈉溶液， 用于中和樣品消化后剩余的濃硫酸， 并使（NH4）2SO4轉化為NH4OH， 經加熱生成NH3逸出， 被硼酸吸收。為使樣品消化液中的（NH4）2SO4全部轉化為NH4OH，40% 氫氧化鈉溶液必須過量加入， 用量不夠會造成測定結果偏低， 用量過多則浪費試劑[6] 。硼酸吸收液中混合指示劑的組成和配方有數種， 如溴甲酚綠- 甲基紅、甲基紅- 甲基藍、甲烯藍- 甲基紅等， 但以0.5%溴甲酚綠乙醇溶液和0.1%甲基紅乙醇溶液混合而成的混合指示劑變色比較敏感。指示劑與硼酸吸收液的比例通常使用1：100或2：100。雖然，以硫酸銨作為對照，不能表示蛋白消化游離出氮的程度，卻可以較好監測后續的實驗狀況。

考慮到硫酸與碳酸鈉的反應有兩個不同的終點：2Na2CO3+H2SO4=Na2SO4+2NaHCO3，Na2CO3+H2SO4=Na2SO4+H2O+CO2↑，標定硫酸時要注意選擇合適的指示劑和對應的反應式進行計算。特別是利用全自動電位滴定儀進行標定時，如果選用標準方法[11]，采取硫酸去滴定碳酸鈉時，要注意選用硫酸的物質的量的基本單元是[c（1/2H2SO4）]而非[c（H2SO4）]。

參考文獻

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