高效液相色譜法測(cè)定葉酸片的含量

柳麗新

【摘 要】葉酸是由喋呤啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸等組成的化合物，是一種水溶性B族維生素，相當(dāng)于蝶酰谷氨酸。固定相為：依利特hypersil BDSC18 色譜柱（4.6*250*5u ），乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；葉酸在20～280μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。葉酸的平均回收率為99.3%。本法簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、回收率高，可用于葉酸片中葉酸的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】葉酸片；葉酸；測(cè)定

葉酸是由喋呤啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸等組成的化合物，是一種水溶性B族維生素，相當(dāng)于蝶酰谷氨酸[1-2]。葉酸從菠菜葉中提取純化的，故而命名為葉酸。葉酸對(duì)孕婦尤其重要。葉酸用于預(yù)防胎兒神經(jīng)管畸形，準(zhǔn)媽媽在備孕期間就服用0.4毫克葉酸可以下降胎兒神經(jīng)管畸形率85%[3-4]。如在懷孕頭3個(gè)月內(nèi)缺乏葉酸，可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷，從而增加裂腦兒，無(wú)腦兒的發(fā)生率。人類如缺乏葉酸可引起巨紅細(xì)胞性貧血以及白細(xì)胞減少癥，還會(huì)導(dǎo)致身體無(wú)力、易怒、沒(méi)胃口以及精神病癥狀[5-7]。本文用高效液相法對(duì)葉酸片中的葉酸的進(jìn)行了含量測(cè)定。

1.儀器與試藥

1.1儀器

LC-100（梯度配置）高效液相色譜儀（上海伍豐科學(xué)儀器有限公司） ；CO-1000型色譜柱溫箱（武漢恒信世紀(jì)科技有限公司）；制冷和加熱循環(huán)槽（上海汗諾儀器有限公司）；UV-1800紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；ELGA超純水器（上海瀾銳儀器科技有限公司）；ABS 220-4分析天平（德祥科技有限公司）；3升基本型超聲波清洗器（天津市瑞普電子儀器公司）；TΜ-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2試藥

乙腈（杭州興成化工有限公司）、磷酸（江西省新干縣金成化工廠）、鹽酸（襄樊金譯成精細(xì)化工有限公司）、磷酸氫二銨（淄博市淄川區(qū)鑫川化工廠）、冰醋酸（吳江市龍申化工有限公司）、甲醇（江西省新干縣金成化工廠）、冰乙酸（杭州興成化工有限公司）、四氫呋喃（吳江市龍申化工有限公司）。

2.含量測(cè)定

2.1色譜條件

依據(jù)查閱文獻(xiàn)及考查的結(jié)果，確定色譜條件如下[8-12]。色譜柱為依利特hypersil BDSC18色譜柱（4.6*250*5u ）；乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；流速1.0mL·min-1；柱溫：30℃。理論板數(shù)按葉酸峰計(jì)算應(yīng)不得低于2000。

2.2供試品溶液的制備

取葉酸片適量，研細(xì)，精密稱定至容量瓶?jī)?nèi)，加適量5%氨水超聲溶解，放涼，用水定容，過(guò)0.45μm的濾膜，即得。

2.3對(duì)照品溶液的制備

精密稱取葉酸對(duì)照品約50mg，置50毫升棕色容量瓶中，用5%氨水超聲波振蕩溶解并用水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10毫升，置100毫升棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL溶液中含葉酸100μg）。

2.4陰性干擾試驗(yàn)

按方中比例取葉酸片輔料，按照制備工藝方法制成陰性制劑，按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明：在選定條件下測(cè)得的陰性液吸收曲線在與葉酸相同保留時(shí)間處不存在吸收峰，說(shuō)明此方法具有較強(qiáng)的專屬性。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

制備濃度為20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1、160μg·mL-1、200μg·mL-1、240μg·mL-1、280μg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別精密吸取10μL注入HPLC，記錄色譜圖。以峰面積積分值A(chǔ)（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。試驗(yàn)表明，葉酸對(duì)照品在40～320μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6精密度試驗(yàn)

精密吸取葉酸對(duì)照品溶液10μL重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值，對(duì)照品峰面積積分值的RSD為0.77%。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.7重現(xiàn)性試驗(yàn)

分別稱取同批葉酸片樣品6份，分別制備成供試品，按色譜條件測(cè)定含量，并計(jì)算樣品的RSD值為0.65%，結(jié)果表明，此含量測(cè)定方法的重現(xiàn)性良好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別在0，1，2，3，4h精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，進(jìn)樣測(cè)定，供試品葉酸峰面積積分值的RSD為0.89%。結(jié)果表明葉酸至少在4h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9回收率試驗(yàn)

采用加樣回收試驗(yàn)，取已知含量的同一批供試品各6份，精密稱定，分精密添加一定量的葉酸對(duì)照品，按供試品制備所述方法制備供試品溶液，測(cè)定含量（同時(shí)測(cè)定樣品含量），計(jì)算回收率。6次測(cè)定的平均回收率為99.3%，RSD為0.95%。

2.10樣品含量測(cè)定

依照上述含量測(cè)定方法，測(cè)定葉酸片三批樣品中葉酸的含量，結(jié)果三批樣品的含量分別為標(biāo)示量的99.3%、99.6%、100.1%。

3.討論

葉酸溶于熱的稀鹽酸和硫磺，略溶于氫氧化堿和碳酸堿溶液，微溶于甲醇，不溶于乙醇和丁醇。本實(shí)驗(yàn)采用5%氨水溶解效果較好。分別考察乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1），0.05mol.L-1磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH到3.0）-乙腈（20∶80），乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：20：55∶0.1），乙腈-甲醇-冰乙酸-水（15：15∶3∶67），乙腈-甲醇-四氫呋喃-水（10：15：35∶40），乙腈-甲醇-水（20∶20：60），磷酸二氫鉀6.8g與0.1mol·L-1氫氧化鉀溶液70mL，加水稀釋至800mL，調(diào)節(jié)pH至6.3，加甲醇200mL，用水稀釋成1000mL，磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L磷酸氫二銨溶液， 用磷酸調(diào)節(jié)pH 值6.0）-乙腈（60：40）不同比例的流動(dòng)相，結(jié)果以乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）為流動(dòng)相，供試品各峰分離效果最好，故選用乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)方法是一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、安全的測(cè)定葉酸片含量的方法。葉酸片中葉酸的含量為標(biāo)示量的95-105%。 [科]

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