神經生長因子在大鼠彌漫性軸索損傷后對NgR蛋白表達的影響

李威 楊立堅 譚龍等

【摘要】目的：研究神經生長因子（NGF）對大鼠自由落體腦損傷后腦內NgR蛋白表達的影響。方法：將80只S-D雄性大鼠隨機分為4組：即正常對照組，假手術組，腦損傷（DAI）模型組，DAI后NGF治療組。復制大鼠自由落體腦損傷模型，在外傷后1d、3d、7d、14d，利用免疫組化染色檢測神經細胞內NgR蛋白表達的變化。結果：腦內NgR蛋白的表達水平在頭部損傷后明顯下降，在傷后3天降到最低，此后逐漸恢復，到第7天基本恢復傷前水平，但之后逐漸升高，14天后表達水平明顯增高。DAI組各時段的NgR陽性蛋白表達均高于同時段正常對照組及假手術組，差異有統計學意義；NGF治療組能抑制DAI后NgR的表達，與同時段模型組對比差異有統計學意義；P值均<0.05。結論：NgR在大鼠受到腦外傷后表達顯著增高，其可抑制中樞神經損傷后的再生，NGF能拮抗這一作用，從而可能在促進腦外傷后神經再生修復中起到作用。

【關鍵詞】彌漫性軸索損傷；神經再生；NgR蛋白；神經生長因子；免疫組化染色

【中圖分類號】R322.81【文獻標識碼】B【文章編號】1005-0019（2015）01-0056-02

隨著人類交際及流動范圍的迅速擴大、延伸，伴之交通手段的快速發展，工業意外、生活意外、高速公路車禍等的發生率不斷上升，創傷的發生率躍居全球三大死因之一[1]。目前顱腦損傷的嚴重程度不斷加重，致殘率和死亡率極高，給社會和家庭都造成極大危害。彌漫性軸突損傷（DiffuseAxonalInjury，DAI）是TBI中最嚴重的類型之一。DAI系當頭部遭受直線或旋轉加速性暴力時，因剪切力而造成的神經軸索損傷。顱內不同組織密度不一，在頭顱受到外力時所產生的加速度也不一樣。因此，這種損傷好發于不同密度的組織結構之間。DAI屬原發性閉合性顱腦損傷，占顱腦損傷29%～53.5%。其臨床特點為病情危重，昏迷時間長，傷殘率和死亡率高[2]。目前認為DAI可能是導致顱腦損傷病人植物生存或嚴重神經功能障礙的最主要原因（顱腦傷后DAI引起的神經傳導阻滯是導致顱腦傷動物神經功能障礙的主要原因）。

神經生長因子（Nervegrowthfactor，NGF）的作用機理是縮短神經肌肉動作電位潛伏期，并提高神經肌肉動作電位幅度，減輕神經髓鞘腫脹發生率和降低變性神經纖維的數量，促進損傷神經的恢復。NGF可以促進神經細胞的存活和成熟，調節神經元的可塑性，對神經纖維的生長方向起引導作用，NGF對神經的保護和損傷修復作用，加速神經纖維再生，減輕繼發性損傷。

本研究通過制備大鼠DAI標準模型，對DAI后大鼠分別肌肉注射鼠神經生長因子，觀察各組大鼠腦組織NgR蛋白的表達，探討并觀察NGF對大鼠NgR表達的影響及對神經損傷后的再生作用，為進一步研究腦彌漫性軸索損傷有效治療方式提供動物實驗依據。

1材料與方法

1.1動物及試劑實驗用SPF級SpragueDawley大鼠，雄性，體重250-300g（購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）。飼養條件：2只/籠，自由進食進水，室溫維持25℃左右，12小時光照/黑暗循環。動物隨機分為4大組：正常對照組，假手術組，腦損傷（DAI）模型組，DAI后NGF治療組。各組又分1d組、3d組、7d組、14d組，每組各5只。鼠神經生長因子，18ug/支，廈門北大之路生物工程有限公司生產，18ug以2ml生理鹽水配制，治療組大鼠均每日按1ml/kg肌注1次；所有二抗、ABC和DAB試劑盒購自美國Vector公司。

1.2實驗方法

1.2.1DAI模型制備：采用MarmarouA等[3]的方法。稱重，腹腔注射10%水合氯醛（4ml/kg）麻醉大鼠，頭頂部備皮，切開皮膚，分離各層組織，暴露顱骨項部位于冠狀縫和人字縫之間的顱骨穹隆處，將一直徑為lcm的不銹鋼墊片固定于人字縫之前，待大鼠意識狀態基本恢復正常后行頭部撞擊。將大鼠俯臥固定于致傷裝置的海綿床上。保證大鼠頭部位置端正，并使墊片的中央正對致傷裝置有機玻璃管的下口。重錘（鋼質，50g）從指定的高處（1.5m）自由下落致圓盤形的墊片上，海綿床連同大鼠要在打擊后迅速撤離引導管下方以確保是單次打擊。檢查顱骨項部是否有骨折發生，縫合頭皮。棄除撞擊后死亡的大鼠以及顱骨發生骨折的大鼠，選取打擊后動物立即出現昏迷（驚嚇反射、角膜反射、痛覺反射消失），且昏迷時間長于3～5min，作為模型。假手術組的大鼠進行同樣的撞擊前的手術及準備，但不予以致傷。

1.2.2DAI后NGF治療組制備：DAI造模成功后，治療組大鼠均每日按1ml/kg肌注鼠神經生長因子1次，注射部位為大腿后側肌肉。

1.2.3組織切片制備：致傷后按實驗設計時間點10%水合氯醛麻醉大鼠，以O.9%生理鹽水（200～300m1）行心腔灌注沖洗后，用多聚甲醛灌注固定液（約350m1）灌注固定，迅速斷頭取全腦，置于4%多聚甲醛固定液中后固定24h。組織塊經脫水、透明、石蠟包埋成塊。石蠟切片機水平面進行連續的組織切片，切片厚度為4μm，經展片后使用載玻片撈取切片烤干備用。

1.2.4免疫組織化學染色：取脫蠟切片投入PBS緩沖液，經抗原修復液95°C存放20min，緩沖液清洗2次，再入0.3%H2O2溶液內室溫20min，以消除內源性過氧化物酶。然后，切片孵育在2%小牛血清溶液中1小時，以減少非特異性反應。一抗NogoR經1%小牛血清與0.15%TritonX100緩沖液配制。每片滴加100μlNogoR（1：200）抗體中孵育4°C過夜，次日經緩沖液洗滌3次后，加相應抗兔二抗（1：400）溶液，室溫孵育1小時，緩沖液洗滌3次后，加生物素與卵白素結合（ABC）試劑盒配置的混合液中培育1小時。底物呈色反應劑采用DAB。呈色反應后，切片經逐級脫水并中性樹脂封片。每例標本測5張切片，取被檢各區之均值。顯微鏡觀察拍照。

1.3圖像分析：在日本產NikonEclipse80i顯微鏡下觀察結果，并用NikonDS高分辨率數碼像機經NIS-ElementsAR3.0軟件拍照。對每個組織切片均通過拍照收集全組織切面圖像。結果分析，采用Ver.3.00程序軟件作圖像數字采集及半定量分析。

1.4統計學處理：實驗數據以X±s表示，治療前后均數的比較采用配對t檢驗。用SPSS13軟件包進行處理。以P<0.05有統計學意義。

2結果

2.1一般情況：存活大鼠打擊后多數即刻昏迷，呼吸暫停數秒至數十秒不等，自主呼吸恢復后呼吸由慢轉快，有的還可見張口呼吸、尖叫、呻吟等反應。多數大鼠出現了持續15～30s甚至更長時間的全身痙攣，還有部分大鼠在昏迷期間出現了角弓反張、前肢屈曲等狀態。蘇醒后存活的大鼠以上癥狀會逐漸好轉，但普遍出現反應遲鈍、活動和進食減少的現象，也有嚴重者會遺留前肢肌力下降、偏癱、腸梗阻或腸穿孔等癥狀，約有70%以上的大鼠打擊后存活。

2.2免疫組化染色：NgR陽性細胞主要分布于大腦皮層、皮層下、海馬、下丘腦等處，其中在大腦皮層與海馬相連部位的少突膠質細胞有很強的免疫陽性反應。NgR免疫反應陽性少突膠質細胞主要為橢圓形，可有明顯的突起。實驗選取大腦皮層與海馬CA1區之間部位中陰性和陽性計數后計算陽性率。如表1所示：致傷后1天，NgR表達輕度下降；到第3天，軸索的NgR表達則有較明顯下降（P<0.05）；到致傷后第7天，軸索的NgR表達恢復至正常時水平；進展至致傷的第14天，NgR表達有較明顯的升高。NGF治療組在每個時間段的NgR表達水平均明顯較DAI模型組低（P<0.05）。

3討論

顱腦損傷后高致殘率和死亡率的原因很大程度上要歸于中樞神經系統（CNS）再生障礙。在CNS的再生修復過程中，神經抑制因素被認為占據優勢。CNS環境中的抑制作用主要來源于兩方面：膠質瘢痕和髓鞘，后者是由少突膠質細胞形成。髓鞘相關蛋白（MAG）、少突膠質細胞髓鞘糖蛋白（OMgp）及Nogo蛋白是三種主要的髓鞘蛋白，是目前發現的對中樞神經再生起抑制作用的主要物質。它們通過與Nogo66受體（NgR）結合靶動一系列再生抑制進程。NgR通過與上述三種髓磷脂相關蛋白結合，接受來自這些抑制分子的抑制信號，是三種髓磷脂相關蛋白的作用焦點。通過NgR受體復合物的介導，細胞內的RhoA信號通路被激活，最終導致神經元軸突生長錐的潰變，阻斷軸突的再生[4]。由于NgR在軸突再生抑制信號的胞內外傳導途徑中起著樞紐作用，在NgR這一環節阻斷抑制信號的傳導可以促進中樞神經的再生。

神經生長因子（NGF）遍布于神經元的胞體、胞質和突起，也廣泛分布于神經系統和非神經系統的組織和器官。NGF其在中樞神經系統作用主要表現為以下幾個方面：①在神經系統的發育過程中主要表現為促進神經元的分化、誘導神經纖維定向生長、控制神經元存活的數量、刺激胞體和樹突的發育以及影響神經纖維支配靶區的密度。②在損傷的神經元其作用主要表現在保護神經元、促進神經元修復、抗神經元凋亡以及促進神經纖維再生，減少受損神經細胞的死亡和調控受損神經元的基因表達，促進效應神經元功能的修復，通過受體介導細胞內信號傳導，激活各種分化因子，發揮神經趨化作用，引導和加快軸突再生長[5]。

本次研究發現NgR蛋白在致傷后1天稍有下降，第3天明顯下降，第7天恢復近正常水平，14天后又明顯升高。上述結果說明DAI誘導腦組織的NgR蛋白水平下降，從而降低Nogo-A及其他髓鞘生長抑制物的作用，為再生修復創造有利條件，但這種自身機體的下調持續時間顯然并不夠長久，還不足以維持到損傷軸索的完全修復。應用NGF治療的組別，其NgR的表達較模型組受到明顯的抑制。本研究結果表明，在DAI早期應用NGF，可以抑制腦組織中NgR蛋白的表達，促進受損神經的再生及修復。其作用機制可能是NGF可以通過介導神經細胞內Nogo抗體信號的傳導，阻斷Nogo、MAG及Omgp與NgR的結合，拮抗Nogo蛋白等抑制中樞神經元軸突再生及誘導軸突生長錐潰變作用，由此可能在促進中樞神經損傷后的神經再生修復中起到重要作用。

參考文獻

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[2] 江基堯，朱誠。現代顱腦損傷學。第1版。上海：第二軍醫大學出版社，1999，215-222.

[3] MarmarouA，FodaM，VandenbrinkWjeta1.Anewmodelofdiffusebraininjuryinrats.PathophusiologyandiomechanicsNeurosurg，1994，80（24）：291～300.

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