新生BALB/c小鼠口服滅活幽門螺桿菌對(duì)特異性抗體的影響作用

楊鈺欣 江吉富

【摘要】目的：探索BALB/c小鼠新生期口服滅活幽門螺桿菌（H.pylori）后能否產(chǎn)生特異性sIgA與IgG。方法：將24只BALB/c小鼠分為三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第Ⅰ組為PBS對(duì)照組，第II組為滅活H.pylori組，第Ⅲ組為滅活H.pylori加大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（LTB）組。用相應(yīng)抗原成分對(duì)各組出生24小時(shí)以內(nèi)的新生BALB/c小鼠進(jìn)行灌胃免疫，末次免疫兩周后，檢測(cè)小鼠血清抗幽門螺桿菌IgG及胃粘膜抗幽門螺桿菌sIgA。結(jié)果：Ⅰ、II、Ⅲ組血清特異性IgG濃度分別為2.1±0.67、8.84±1.07、37.50±4.87ng/ml；胃粘膜特異性sIgA濃度分別為1.60±0.49、1.96±0.47、6.56±1.24ng/ml。Ⅲ組血清IgG濃度與胃粘膜sIgA濃度分別與Ⅰ、II進(jìn)行比較，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；II組血清IgG濃度與其余兩組進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而該組sIgA濃度與其余兩組的比較顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：在BALB/c小鼠新生期給予滅活幽門螺桿菌與LTB灌胃免疫后能使機(jī)體胃粘膜特異性sIgA與血清IgG顯著增高。

【關(guān)鍵詞】滅活幽門螺桿菌；LTB；新生BALB/c小鼠。

【中圖分類號(hào)】R341【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1005-0019（2015）01-0088-01

前言

幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，H.pylori）是人類最常見(jiàn)的病原菌之一，主要定植于人胃內(nèi)。它是導(dǎo)致慢性胃炎，十二指腸和胃潰瘍以及胃癌的一個(gè)重要致病因子。除此之外，它還是胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤發(fā)展的一個(gè)重要因素，WHO將其歸為I類致癌因子。幽門螺桿菌感染在全世界廣泛流行，研究顯示，全球已有48%的人感染這種細(xì)菌，發(fā)展中國(guó)家的感染率高達(dá)68%。其主要在兒童期感染，5歲以下幼兒具有較高的再感染率，目前，H.pylori感染臨床治療尚以三聯(lián)療法為主。但存在著細(xì)菌耐藥率逐年增加、患者依從性差、以及容易再次感染等諸多問(wèn)題。H.pylori感染是一類特殊的感染，它生存于胃粘膜細(xì)胞外。根據(jù)這一特性，相關(guān)研究認(rèn)為預(yù)防和治療H.pylori感染的主要方式是阻止粘膜發(fā)生免疫耐受，并誘導(dǎo)粘膜層產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)。sIgA作為主要的粘膜保護(hù)性抗體，它的主要作用是能夠防止細(xì)菌和病毒在粘膜表面定植和進(jìn)一步感染，可抑制細(xì)菌抗原的攝取、阻止H.pylori的粘附、移動(dòng)，以及中和毒素，但其在胃腸外基本無(wú)效[1]。因此，目前H.pylori疫苗的免疫接種方法主要是通過(guò)口服，由于多數(shù)抗原經(jīng)口服后其免疫原性都非常弱，不能靶向地被運(yùn)載至腸道的粘膜免疫系統(tǒng)；同時(shí)，這些抗原極易被消化和降解，且胃腸的吸收率較低，常規(guī)免疫劑量無(wú)法刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答反應(yīng)。要研制有效的H.pylori口服疫苗，除了要確立有效的抗原成分外，選擇合適的免疫佐劑非常重要。大量研究證實(shí)LTB（大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位）能有效地誘導(dǎo)粘膜免疫的產(chǎn)生，且與LT（大腸桿菌不耐熱腸毒素）的另一亞單位LTA（大腸桿菌不耐熱腸毒素A亞單位）相比，具有明顯的低毒性。由鄒全明等人研制的用LTB作為分子內(nèi)佐劑的口服重組H.pylori亞單位疫苗在臨床試驗(yàn)中取得了良好的效果[2]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，H.pylori的感染在出生后0—1歲就已有發(fā)現(xiàn)[3，4]。這樣看來(lái)，似乎在新生期接種疫苗才能達(dá)到預(yù)防H.pylori感染的目的。因此，在本實(shí)驗(yàn)中選用LTB作為粘膜佐劑，對(duì)新生小鼠進(jìn)行灌胃免疫，并觀察其免疫效果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與儀器哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、H.pylori培養(yǎng)選擇性添加劑購(gòu)自英國(guó)OXIOD公司；布氏肉湯購(gòu)自杭州天和有限責(zé)任公司；三元混合氣體（O2、CO2、N2）購(gòu)自貴陽(yáng)申建氣體有限責(zé)任公司；LTB購(gòu)自Sigma公司；抗H.pyloriIgGELISA檢測(cè)試劑盒及抗H.pylorisIgAELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BG公司。恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272）購(gòu)自上海一恒有限責(zé)任公司；酶標(biāo)儀（MK3）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；細(xì)菌比濁儀（VITEM004120）購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

1.1.2菌株幽門螺桿菌NCTC11637（購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病防治研究所）。

1.1.3動(dòng)物模型BALB/c小鼠（購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所），清潔級(jí)，雌雄兼用，自由飲水，分籠飼養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1H.pylori滅活全菌體的制備

將NCTC11637接種于含5%無(wú)菌脫纖維綿羊血的哥倫比亞血瓊脂平板上，置密封的玻璃培養(yǎng)罐內(nèi)，充入混合氣體（O2：5%、CO2：10%、N2：85%），37℃恒溫培養(yǎng)，3～4天后取出，用PBS從平板上洗脫，置60℃水浴箱1小時(shí)，使細(xì)菌滅活，取滅活菌液接種到哥倫比亞血瓊脂平板，按上述條件進(jìn)行培養(yǎng)，3～5天后觀察無(wú)活菌生長(zhǎng)。然后將收集的菌液離心，5000r/min，20分鐘，濃縮菌體，去掉上清液，用PBS清洗兩次，用比濁法配制成終濃度為2×109/ml的H.pylori滅活菌液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2LTB的溶解

LTB臨用前用500μl超純水溶解，溶解時(shí)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，避免產(chǎn)生汽泡，LTB終濃度為1μg/μl，完全溶解后便可使用，余下可放-40℃短期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組

根椐不同的免疫劑型分為三組（如表1所示）。

表1實(shí)驗(yàn)分組

分組疫苗組成對(duì)照組（I）（8/group） PBS疫苗A組（II）（8/group） 滅活的H.pylori疫苗B組（III）（8/group） 滅活的H.pylori+LTB1.2.4免疫方法

免疫動(dòng)物與數(shù)量：均為出生后第0天（24h以內(nèi)）BALB/c小鼠，共24只，16只/每組。免疫劑量：I組為50μlPBS，II組為50ul（含108CFU）滅活全菌，III組為50μl（含108CFU）滅活全菌加5μgLTB。免疫時(shí)間：出生后第0、7、21天。第0天灌胃兩次，兩次中間隔6小時(shí)；第7、21天各免疫1次。免疫程序：第0天免疫時(shí)，將24小時(shí)以內(nèi)出生的BALB/c小鼠與母鼠分離3小時(shí)后，進(jìn)行灌胃，灌胃完畢，繼續(xù)放入籠中（與母鼠隔離），4小時(shí)后，再次按照上述方法給予第二次灌胃，免疫結(jié)束2小時(shí)后，將母鼠放回籠中。第7、21天各免疫1次，第7天免疫前，與母鼠隔離6小時(shí)，免疫方法同前，免疫2小時(shí)后放回母鼠籠中。第21天免疫前斷食24小時(shí)，斷水4小時(shí)以后進(jìn)行灌胃，免疫2小時(shí)后恢復(fù)食水。

1.2.5抗H.pyloriIgG、sIgA檢測(cè)

1.2.5.1標(biāo)本采取

實(shí)驗(yàn)組取末次免疫兩周后（第35天）小鼠，斷食12小時(shí)，斷水4小時(shí)，摘除眼球取血，置37℃半小時(shí)后，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆茫瑱z測(cè)特異性IgG。將取血致死的小鼠腹部剪開(kāi)，從賁門處到幽門處剪取胃組織，去除胃內(nèi)容物，用小剪刀將胃組織剪碎，再移置200目不銹鋼網(wǎng)上，然后加入1ml蒸餾水進(jìn)行研磨，將研磨后的細(xì)胞懸液離心，5000r/min，離心20分鐘。取上清液，-20℃保存?zhèn)溆茫瑱z測(cè)特異性sIgA。

1.2.5.2血清特異性IgG檢測(cè)

按照BG公司ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。終止反應(yīng)后30分鐘內(nèi)在波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度值。

1.2.5.3胃組織標(biāo)本特異性sIgA檢測(cè)

按照BG公司ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。終止反應(yīng)后5分鐘內(nèi)在波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算濃度值。

2結(jié)果（用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析）

各組血清特異性IgG，胃粘膜特異性sIgA濃度（如表2、圖1、2所示）

從表3-1中可以看出第Ⅲ組的特異性IgG及sIgA濃度明顯高于第Ⅰ、Ⅱ組，其中，Ⅱ組IgG濃度與Ⅰ、Ⅲ組相比，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ⅲ組IgG濃度與Ⅰ、Ⅱ組相比，結(jié)果亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Ⅲ組sIgA濃度分別與Ⅰ組和Ⅱ組相比，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ⅰ組與Ⅱ組sIgA濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

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4討論

早在90年代初期，有關(guān)H.pylori疫苗的研究就已經(jīng)開(kāi)始。近年來(lái)，有著各種各樣關(guān)于H.pylori疫苗的研究。根據(jù)疫苗的構(gòu)成不同，可將其分為全菌疫苗、亞單位疫苗、表位疫苗、載體疫苗等。亞單位疫苗的結(jié)構(gòu)與組成較為明確，是可引起免疫保護(hù)的一類蛋白質(zhì)、脂多糖等微生物組分。與亞單位疫苗相比，全菌疫苗的優(yōu)點(diǎn)是能誘發(fā)針對(duì)細(xì)菌各種抗原的免疫應(yīng)答[5]。但是這些蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答機(jī)制仍然不十分清楚，另一方面，現(xiàn)在仍然不能確定對(duì)H.pylori整個(gè)菌體有效的理想疫苗，應(yīng)該誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的效應(yīng)因子是什么（例如抗體、CD4+亞群、細(xì)胞因子等）。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)抗H.pylori特異性IgG及sIgA來(lái)觀察用滅活H.pylori加或不加LTB灌胃免疫新生小鼠后，能否誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示，抗H.pyloriIgG及sIgA濃度有所增高，提示滅活幽門螺桿菌加LTB能誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性的全身及粘膜免疫反應(yīng)。雖然滅活H.pylori不加LTB組IgG濃度的增高與PBS組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但該組特異性sIgA卻未見(jiàn)明顯增高，這一結(jié)果證明了抗原經(jīng)消化道免疫的特殊性（極易被消化和降解）及佐劑在粘膜免疫中的重要性[6]。因蛋白質(zhì)包括疫苗到達(dá)粘膜誘導(dǎo)部位是一種誘導(dǎo)全身無(wú)應(yīng)答性（粘膜誘導(dǎo)耐受性）的有效途徑，雖然粘膜誘導(dǎo)耐受是防止自身免疫疾病的有效途徑，但此特征可導(dǎo)致宿主對(duì)感染應(yīng)答能力的喪失[7]。本實(shí)驗(yàn)用LTB作為粘膜免疫佐劑，試圖增強(qiáng)滅活H.pylori在胃粘膜的的抗原性，結(jié)果顯示特異性IgG及sIgA抗體濃度較不加LTB組顯著增高，提示用LTB作為佐劑用于新生BALB/c小鼠的消化道粘膜免疫是可行的，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符[12]。雖然sIgA是公認(rèn)的粘膜表面主要的免疫球蛋白，是機(jī)體抵抗外來(lái)病原體的第一道防線，它們幫助機(jī)體抵御病原體經(jīng)由粘膜上皮的感染，防止病原體和毒素進(jìn)入細(xì)胞[8]。但新生期免疫產(chǎn)生的這兩種抗體對(duì)于H.pylori的感染是否有免疫保護(hù)作用，我們將進(jìn)一步進(jìn)行探索研究。

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