柚子皮渣生產單細胞蛋白飼料工藝研究

張海濤 楊海君 劉文斌等

摘 要：以柚子皮渣為原料，以康寧木霉、白地霉、酵母菌、產朊假絲酵母為菌體，用卵清蛋白為標準品和雙縮脲試劑制定標準曲線，探究單菌株與混合菌株分別固態(tài)發(fā)酵后產單細胞蛋白的含量。結果表明：白地霉與康寧木霉組合菌發(fā)酵效果最好，培養(yǎng)基發(fā)酵7d后蛋白質含量達到8.060g，占培養(yǎng)基干重的19%左右。發(fā)酵效果受溫度、pH值、接種量、培養(yǎng)基含水量等因素影響，用正交實驗獲得白地霉與康寧木霉最佳發(fā)酵條件組合為：最適pH值5.5，最適發(fā)酵溫度25℃，最適接種量15%，最適培養(yǎng)基含水量65%，且各因素對發(fā)酵的影響大小為發(fā)酵溫度>培養(yǎng)基含水量>接種量>pH。

關鍵詞：固態(tài)發(fā)酵；單細胞蛋白；影響因素；單菌；混合菌

中圖分類號 S816.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）19-105-04

Study on the Process of Producing Single Cell Protein Feed by the Skin of Grapefruit

Zhang Haitao1，2 et al.

（1 Hunan Agricultural University，Changsha 41000，China；2 Hunan University of Science and Engineering，Yongzhou 425000，China）

Abstract：Taking grapefruit bran as raw material，koningii，white mold，yeast，geotrichum as fermentation bacteria.through the standard curve with ovalbumin and Biuret reagent. the paper probed the single cell protein content after solid-state fermentation of single strain and mixed strain. It was found that the combination of Geotrichum with koningii has the best fermentation effect，and after 7d fermentation the medium content 8.060g protein，accounting for about 19% of the dry weight of the medium.Fermentation affected by the temperature，pH，inoculum size，mediums water content. The orthogonal experiment showed that the combination of Geotrichum with koningii s best fermentation condition ，the optimum pH value is 5.5，the optimum fermentation temperature is 25℃，the optimum inoculation amount is 15%，the optimum medium moisture content is 65%. The impact of various factors on fermentation is fermentation temperature>mediums water content> inoculation amount>pH.

Key words： Solid state fermentation；Single cell protein；Influencing factors；Single strain；Mixed strain

傳統柚子果實加工后剩下的大量柚子皮往往被隨意丟棄或集中作一般處理，對環(huán)境造成污染的同時也造成了資源浪費。研究表明，柚子皮中含有5%的果膠，還含有豐富的油皮苷、胡蘿卜素、VB、VC、VP以及有機酸和高級醇，并且可以提取精油、柚苷[1]，因此柚子皮可以作為一種發(fā)酵基質，為微生物的生長提供豐富的營養(yǎng)成分。單細胞蛋白所含的物質成分豐富，被廣泛用于飼料加工中，通過柚子皮渣固態(tài)發(fā)酵來生產單細胞蛋白，從而提高柚子皮中粗蛋白含量，使柚子皮作為一種飼料供動物食用，同時解決了廢棄柚子皮渣對環(huán)境的污染，具有良好的社會效益和經濟效益。本研究以柚子皮渣為原料，以白地霉、酵母菌、產朊假絲酵母、康寧木霉單菌種以及它們的混合菌種為發(fā)酵菌種[2]，篩選出最佳混菌組合以及最佳發(fā)酵條件，對提高柚子皮渣固態(tài)發(fā)酵效率和粗蛋白產量，以及保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 （1）牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基：在燒杯內加蒸餾水100mL，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化鈉0.5g，瓊脂1.5g。燒杯外標記，加熱溶解后加入瓊脂，不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解后補足失水，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調整pH值為5.0～6.5，分裝在各個試管內，高壓蒸汽鍋內121℃滅菌30min，室溫后倒入試管制成斜面（8個），冷卻后保存?zhèn)溆谩＃?）液體牛肉膏培養(yǎng)基制備：在燒杯內加蒸餾水100mL，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化鈉0.5g。燒杯外標記，加熱溶解，補足失水，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調整pH值為5.0～6.5，分裝于8個三角瓶中，高壓蒸汽鍋內121℃滅菌30min，冷卻至室溫后備用。（3）柚子皮渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備：柚皮渣80g，麩皮20g，尿素1.5g，硫酸銨1.5g，磷酸氫二鉀0.6g，硫酸鎂0.05g，水65～70g，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調pH值為5.0～6.5，高壓蒸汽鍋內121℃滅菌20min。

1.1.2 主要試劑與儀器 硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂為分析純，購于上海永葉生物科技有限公司；其它化學試劑均為分析純。TG16C/TG16臺式高速離心機，PHS-802中文臺式酸度計，722型分光光度計等。

1.1.3 菌種 4株菌株都為真菌，分別為白地霉（Geotrichum candidum）；產朊假絲酵母（Candida utilis）；康寧木霉（Corning Trichoderma）；酵母菌（Yeast）。從武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）購買，放冰箱冷凍保藏備用。

1.1.4 柚皮渣與麩皮來源 柚子為江永的香柚，將柚子洗干凈剝開，取其柚子皮（果實以外的部分）用刀切成小塊狀，然后放入干燥箱里烘干至恒量，用研缽研碎，過100目篩，放干燥處室溫保存?zhèn)溆谩Ｋ玫柠熎挠乐菔辛懔陞^(qū)的農產品市場購買，然后經過20目篩篩選后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 雙縮脲試劑的配制 將1g氫氧化鈉溶于10mL水中，制成雙縮脲試劑A；將0.1g硫酸銅溶于10mL水中，制成雙縮脲試劑B。

1.2.2 菌種的活化與保藏 將冷凍保存的4菌株接種于4個斜面培養(yǎng)基上活化，在22～35℃條件下培養(yǎng)48h，再將斜面菌種挑取一環(huán)接于液體試管培養(yǎng)基中，22～35℃培養(yǎng)48h，作為一級種子培養(yǎng)基；以10%接種量接入裝液量20mL/50mL于三角瓶液體培養(yǎng)基中，于22～35℃ 240r·min-1振蕩培養(yǎng)24h，作為二級種子培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 標準曲線的制作 用卵清蛋白作為標準樣品制作標準曲線。準確稱取卵清蛋白，以蒸餾水為溶液配制成2.0mg·mL-1的蛋白質溶液，取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL分別注入7支比試管中，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B，在15～25℃下放置30min，以介質溶液調零，測定標準液在560nm處的吸光度。

1.2.4 單菌種的發(fā)酵 用移液槍分別取4種二級種子培養(yǎng)液各4mL接種于4個不同的已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同菌種時更換一次槍頭），置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，以粗蛋白質含量為檢測指標，分析各個菌種發(fā)酵前后產物中蛋白質含量的變化情況。

1.2.5 組合菌株的發(fā)酵 （1）雙菌種的發(fā)酵。將4菌株分別“兩兩組合”，同時按1∶1的比例各取2mL二級種子培養(yǎng)液接種于已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同菌種時更換一次槍頭）置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，記錄數據。（2）3菌種的發(fā)酵。將4菌株分別“三三組合”，同時按1∶1∶1的比例各取1.3mL二級種子培養(yǎng)液接種于已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同菌種時更換一次槍頭）置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，記錄數據。（3）4菌種的發(fā)酵。將4菌株分別按1∶1∶1∶1的比例各取1mL二級種子培養(yǎng)液接種于已滅菌的柚皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上（每取不同種菌種時更換一次槍頭）置于22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒量。

1.2.6 粗蛋白質含量的測定 （1）單菌種發(fā)酵培養(yǎng)皿中粗蛋白質含量的測定：從單菌種發(fā)酵的4個培養(yǎng)皿中取烘干之后的培養(yǎng)物各5g，分別用研缽研碎后倒入試管中，然后滴加95%乙醇，搖晃試管5min，取上清液于離心管中，反復3次，離心完成之后倒掉液體，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B（共2mL，A∶B=3∶1），搖晃離心管，然后將雙縮脲倒入分光光度計玻璃柱中進行檢測。（2）組合菌種發(fā)酵培養(yǎng)皿中粗蛋白質含量的測定：從組合菌種發(fā)酵的4個培養(yǎng)皿中取烘干之后的培養(yǎng)物各5g，分別用研缽研碎后倒入試管當中，然后滴加95%乙醇，搖晃試管5min，取上清液于離心管中，反復3次，離心完成后倒掉液體，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B（共2mL，A∶B=3∶1），搖晃離心管，然后將雙縮脲倒入分光光度計玻璃柱中進行檢測。

1.2.7 發(fā)酵因子對最佳菌種組合產粗蛋白質量的影響[3-4]

1.2.7.1 發(fā)酵溫度 按1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉菌溶液各2mL混合，平均加入到7個已滅菌的固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基中，分別放入溫度為10、15、20、25、30、35、40℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測不同溫度產物中蛋白質含量。

1.2.7.2 發(fā)酵pH值 按1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉溶液各2mL混合，平均加入到7個已滅菌的固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基中，分別調節(jié)pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5后放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測不同pH值條件下產物中蛋白質含量。

1.2.7.3 接種量 按照1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉溶液分別以接種量10%、15%、20%、25%、30%對固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基進行發(fā)酵，調pH值為5.5，放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測產物中蛋白質含量。

1.2.7.4 培養(yǎng)基的含水量 按1∶1取相同體積的康寧木霉與白底霉溶液各2mL，平均加入到7個已滅菌的固態(tài)柚子皮渣培養(yǎng)基中（pH值為5.5），分別調節(jié)培養(yǎng)中的含水量為50%、55%、60%、65%、70%，放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，檢測產物中蛋白質含量。

1.2.8 正交實驗 發(fā)酵溫度、pH值、接種量、培養(yǎng)基的含水量都對菌種的生長代謝產生影響，通過取4因素（溫度、pH、目篩目數、含水量）3水平的正交實驗來確定最佳發(fā)酵條件組合[5]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線 用卵清蛋白作為標準樣品來制作標準曲線，通過計算稱量后，準確稱取卵清蛋白，以蒸餾水為溶液配制成2mg·mL-1的蛋白質溶液，分別取出0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL注入7支比試管中，先加入雙縮脲試劑A再加入雙縮脲試劑B（共2mL，A∶B=3∶1），在15～25℃下放置30min，調零，測定560nm處的吸光度依次為0、0.182、0.311、0.453、0.581、0.705、0.837，根據數據繪制標準曲線，如圖1所示。

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼w763-1.tif>[y=0.4556x+0.0284

R2=0.9969][標準蛋白質溶液體積（mL）][吸光度（A）][1

0.8

0.6

0.4

0.2

0][0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1]

圖1 標準曲線

2.2 粗蛋白質的檢測結果 根據測得的吸光度通過標準曲線計算出待測液濃度值，經換算可得粗蛋白產量。

2.2.1 單菌種發(fā)酵后粗蛋白的檢測結果 康寧木霉、產阮假絲酵母、酵母菌、白地霉4菌種分別發(fā)酵后的粗蛋白含量為5.377g、4.723g、4.197g、6.316g，白地霉發(fā)酵獲得的粗蛋白含量最高，達到6.316g。

2.2.2 混合菌種發(fā)酵后粗蛋白質含量的檢測結果 不同菌種混合在相同條件下發(fā)酵后的粗蛋白含量如表1所示，從表1可知，11組混合菌中，白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵產生的粗蛋白含量最高，達到8.060g。

表1 不同混菌組合發(fā)酵后產生的粗蛋白質含量

[菌種組合＼&粗蛋白質含量（g）＼&產阮假絲酵母+酵母菌＼&5.589＼&白地霉+康寧木霉＼&8.060＼&康寧木霉+酵母菌＼&5.786＼&白地霉+產阮假絲酵母＼&7.155＼&白地霉+酵母菌＼&4.098＼&康寧木霉+產阮假絲酵母＼&4.240＼&康寧木霉+產阮假絲酵母+酵母菌＼&4.125＼&康寧木霉+白地霉+酵母菌＼&5.554＼&產阮假絲酵母+酵母菌+白地霉＼&5.506＼&康寧木霉+產阮假絲酵母+白地霉＼&5.272＼&康寧木霉+產阮假絲酵母+白地霉+酵母菌＼&6.650＼&]

2.2.3 白地霉與康寧木霉混合固態(tài)發(fā)酵所產粗蛋白的影響因子分析 白地霉與康寧木霉組合在同等條件下固態(tài)發(fā)酵后所產粗蛋白含量最高，取該菌種組合進行影響因子分析，探尋該菌種組合最佳固態(tài)發(fā)酵條件。

2.2.3.1 不同溫度對發(fā)酵產物中粗蛋白含量的影響 分別以10、15、20、25、30、35、40℃進行分組發(fā)酵試驗，發(fā)酵后培養(yǎng)基中粗蛋白的含量如圖2所示，從圖2可知，當溫度為10～25℃時，發(fā)酵后產物中的蛋白質含量不斷增加，且溫度為25℃時，產物中粗蛋白含量為最高，達到8.46g；當溫度為25～40℃時，發(fā)酵后產物中的粗蛋白含量呈下降趨勢，且溫度在35～40℃范圍內下降得最為明顯。因此，可認定25℃為康寧木霉與白地霉菌種組合的最佳反應溫度。

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼w763-2.tif>[粗蛋白含量（g）][10

8

6

4

2

0][0 10 20 30 40 50][溫度（℃）][1.331][5.321][7.941][8.460][7.772][7.125][3.125]

圖2 溫度對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產物中粗蛋白含量的影響

2.2.3.2 不同pH值對發(fā)酵產物中粗蛋白含量的影響 pH值對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵產物中粗蛋白含量的影響如圖3所示。從圖3可知，該菌種組合發(fā)酵產物粗蛋白含量在pH值4～4.5以及5.5～7之間出現先增長后減少的趨勢，而在pH值為5.5時發(fā)酵后的粗蛋白產量最高，達到8.161g。因此，可得出pH5.5為康寧木霉與白地霉組合菌種的最佳反應酸堿度。

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼w763-3.tif>[9

8

7

6

5][粗蛋白含量（g）][4.5 5 5.5 6 6.5 7][pH值][5.321][6.941][8.161][7.027][6.125]

圖3 pH值對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產物中粗蛋白含量的影響

2.2.3.3 不同接種量對發(fā)酵產物中粗蛋白含量的影響 通過接種量的改變，來檢測不同接種量對發(fā)酵產物中粗蛋白含量的影響。從圖4可知，該組合菌種固態(tài)發(fā)酵后產物中粗蛋白產量隨著接種量的改變而改變，當接種量為15%時，最有利于發(fā)酵產物中粗蛋白的產生。

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼w763-4.tif>[8.4

8.2

8

7.8

7.6

7.4][粗蛋白含量（g）][10 15 20 25 30 35][接種量（%）][7.43][8.25][8.11][7.92][7.82]

圖4 接種量對白地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產物中粗蛋白含量的影響

2.2.3.4 不同培養(yǎng)基含水量對發(fā)酵后產物中粗蛋白含量的影響 不同培養(yǎng)基含水量對發(fā)酵后產物中粗蛋白含量的影響如圖5所示，從圖5可知，培養(yǎng)基含水量在50%～70%，該組合菌種發(fā)酵后產物中產粗蛋白的量都比較高，當培養(yǎng)基含水量為65%時，發(fā)酵后產物中的粗蛋白產量最高，達到8.075g。這是因為影響固態(tài)發(fā)酵速率的因素與是否有游離水的存在相關，因此基質含水量的變化對微生物的代謝與生長產生重要的影響。戴超[4]在影響固態(tài)發(fā)酵速率的因素及其控制策略中通過驗證實驗也證明了這一點，可知培養(yǎng)基含水量在65%為康寧木霉與白地霉組合菌種的最佳反應環(huán)境。

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼w763-5.tif>[9

8.58

7.5

7

6.5][粗蛋白含量（g）][50 55 60 65 70 75][培養(yǎng)基含水量（%）][6.845][7.883][8.102][8.705][8.012]

圖5 培養(yǎng)基含水量對地霉與康寧木霉組合發(fā)酵后產物中

粗蛋白含量的影響

2.4 正交實驗結果 取4因素3水平的正交實驗確定最佳發(fā)酵組合如表2所示，從表2可知，最適水平最佳配比組合為A2B2C3D2。從正交表數據可知，溫度25℃、pH值5.5、最佳接種量為15%、培養(yǎng)基含水量65%為最佳條件組合，由R值可知，各因素對發(fā)酵的影響大小為發(fā)酵溫度>培養(yǎng)基含水量>接種量>pH。

表2 4因素3水平正交實驗結果

[試驗號＼&溫度

（℃）＼&pH＼&接種量

（%）＼&培養(yǎng)基含

水量（%）＼&粗蛋白質量（g）＼&1＼&1（15）＼&1（4.5）＼&1（10）＼&1（60）＼&6.026＼&2＼&1（15）＼&2（5.5）＼&2（15）＼&2（65）＼&7.161＼&3＼&1（15）＼&3（6.5）＼&3（20）＼&3（70）＼&8.072＼&4＼&2（25）＼&1（4.5）＼&2（15）＼&3（65）＼&8.883＼&5＼&2（25）＼&2（5.5）＼&3（20）＼&1（60）＼&8.436＼&6＼&2（25）＼&3（6.5）＼&1（15）＼&2（65）＼&6.535＼&7＼&3（35）＼&1（4.5）＼&3（20）＼&2（65）＼&4.323＼&8＼&3（35）＼&2（6.5）＼&1（10）＼&3（70）＼&4.251＼&9＼&3（35）＼&3（6.5）＼&2（15）＼&1（60）＼&3.377＼&Ⅰ＼&14.564＼&13.936＼&16.812＼&17.839＼&T=57.064＼&Ⅱ＼&25.391＼&19.232＼&19.421＼&18.019＼&Ⅲ＼&11.911＼&17.984＼&20.831＼&21.206＼&K1＼&4.854＼&4.312＼&5.604＼&4.170＼&K2＼&8.463＼&6.410＼&6.474＼&6.999＼&K3＼&3.970＼&5.995＼&6.944＼&7.069＼&R＼&4.493＼&2.098＼&1.340＼&2.899＼&]

3 結論

（1）白地霉、產朊假絲酵母、康寧木霉與酵母菌分別發(fā)酵培養(yǎng)后產生的粗蛋白含量為5.377g、4.723g、4.197g、6.316g，白地霉發(fā)酵后產生的粗蛋白質含量最高，達到6.316g。

（2）白地霉、產朊假絲酵母、康寧木霉與酵母菌分別進行2菌種、3菌種以及4菌種混合固態(tài)發(fā)酵，檢測固態(tài)發(fā)酵產物中發(fā)現康寧木霉與白地霉混合柚子皮渣生產蛋白質量高，達到8.060g，占培養(yǎng)基干重的19%左右。

（3）正交實驗采用3水平（溫度：A1=15℃，A2=25℃，A3=35℃；pH值：B1=4.5，B2=5.5，B3=6.5；接種量：C1=10%，C2=15%，C3=20%；培養(yǎng)基含水量：D1=60%，D2=65%，D3=70%）4因素（發(fā)酵溫度，pH，接種量，培養(yǎng)基含水量）進行設計，結果發(fā)現康寧木霉與白地霉菌種混合組最佳條件組合為A2B2C3D2，即在溫度25℃、pH5.5、接種量15%、培養(yǎng)基含水量65%的條件下最有利于柚子皮渣培養(yǎng)基的發(fā)酵。

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